pgpA和tdcG基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响

刘逸寒，乔 婧，李 玉，佟新伟，刘晓光，路福平

(工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

pgpA和tdcG基因的敲除对大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成的影响

刘逸寒，乔 婧，李 玉，佟新伟，刘晓光，路福平

(工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

磷脂酰丝氨酸具有改善大脑的认知和记忆的功能，是医药和食品行业重要的原料．为进一步提高大肠杆菌(Escherichia coli)中磷脂酰丝氨酸含量，利用Red重组系统，以可积累磷脂酰丝氨酸的E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)为出发菌株，敲除pgpA和tdcG基因，切断与磷脂酰丝氨酸合成相关的L-丝氨酸和磷脂酰甘油磷酸的分解代谢途径．摇瓶发酵后的检测结果表明，重组菌株E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpA ΔpgpB ΔtdcG)中磷脂酰丝氨酸占菌体总磷脂的比例为2.5%，较出发菌株(1%)提高了1.5倍．

磷脂酰丝氨酸；大肠杆菌；基因敲除；代谢

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂，是大脑中主要的酸性磷脂．PS有显著的保健功效，能改善老年阿尔茨海默病、提高认知力、抗抑郁、抗压抑、辅助激活酶等[1]．目前，PS产品主要是由大豆中提取制备，也可由磷脂酶催化磷脂酰胆碱和丝氨酸合成，但此催化反应尚处于实验室研究阶段，且该酶的生产成本较高，催化过程较为复杂．PS作为磷脂成分之一存在于微生物体内，因此，可以利用代谢工程手段对微生物体内PS相关代谢途径进行改造，以提高PS合成量，通过微生物发酵法为PS的制备提供新思路．

目前，国内外对大肠杆菌磷脂相关代谢进行了大量的研究．在大肠杆菌中，PS由L–丝氨酸和CDP–

二酰基甘油经PS合成酶(phosphatidylserine synthetase，PSS)催化合成(图1)．Rilfors等[2]发现PSS是一种膜结合酶，当它处于游离状态时没有活性，只有和膜上的磷脂酰甘油磷酸(phosphatidylglycerophosphate，PGP)结合后才具有活性，可见PSS的活性受到PGP调节．Icho[3]和Funk等[4]研究表明，pgpA、pgpB、pgpC此3个基因分别编码3种磷脂酰甘油磷酸酶同工酶PGPA、PGPB、PGPC，该酶催化 PGP 转化为磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol，PG)．Lu等[5]分别敲除pgpA、pgpB、pgpC后，研究PGP在大肠杆菌的积累，发现此3个同工酶基因同时被敲除后会阻断PG的生物合成途径，菌体生长受到限制．另外，Su等[6–7]发现，PS的合成底物之一L–丝氨酸经L–丝氨酸脱氨酶催化后可转化为丙酮酸，sdaA、sdaB、tdcG分别编码L–丝氨酸脱氨酶3种同工酶．Voelker[8]研究表明，PS在磷脂酰丝氨酸脱羧酶(phosphatidylserine decarboxylase，PSD)作用下可以合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)．Ishinaga等[9]发现，大肠杆菌PSS活力提高有利于PE的合成．Vance等[10]分析了PS在大肠杆菌、酵母、植物和哺乳动物中的功能和分布，并简述了PSS酶的调节机制．可见，目前有关PS的研究主要是将其作为PE合成的前体分析，而以提高PS合成量为目的的研究尚未见报道．

本课题组在前期研究中，结合基因工程与代谢工程技术，通过敲除E.,coli K12中2个L–丝氨酸脱氨酶基因sdaA、sdaB和1个磷脂酰甘油酸酶基因pgpB，已成功构建并获得1株PS合成量提高的大肠杆菌重组菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)，其PS占菌体总磷脂含量的1%，而原始菌株E.,coli K12中PS占菌体总磷脂含量＜0.5%．本文在E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)基础上，进一步敲除磷脂酰甘油磷酸酶pgpA基因和L–丝氨酸脱氨酶tdcG基因，通过积累PGP以提高PSS活性和阻断L–丝氨酸分解代谢两个方面进行改造，使PS在大肠杆菌内得到进一步积累，构建PS合成量提高的大肠杆菌重组菌株，为PS的生物合成奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌E.,coliK12、大肠杆菌E.,coli K12 (ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)及所用质粒pKD3、pKD46、pCP20均为本实验室保存．以pKD3为模板可PCR扩增出两侧含有FRT位点的抗性基因，可作为筛选标记．pKD46温敏型低拷贝质粒，42,℃不复制，经L–阿拉伯糖诱导后表达Gam、Beta和Exo这3种λ噬菌体重组蛋白．pCP20用于FRT间抗性基因片段的切除．

1.1.2 培养基和培养条件

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0．用于大肠杆菌培养，37,℃、200,r/min摇床振荡培养．

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂20，pH 7.0．用于大肠杆菌培养，37,℃恒温培养箱静置培养．

液体和固体培养基在需要时添加氨苄青霉素(终质量浓度100,µg/mL)和氯霉素(终质量浓度为25,µg/mL)．

1.1.3 引物

研究所需引物包括用于扩增同时带有同源臂和氯霉素抗性基因的引物和鉴定目的基因是否被成功敲除的引物，见表1，下划线部分为50,bp左右同源臂．

1.2 方法

1.2.1 基因敲除(以敲除基因pgpA为例)

利用Red重组系统对大肠杆菌进行基因敲除(图2)．该系统的质粒包括模板质粒pKD3、Red酶表达质粒pKD46和FLP表达质粒pCP20．

以大肠杆菌E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)为出发菌株，敲除基因pgpA的步骤为：(1)以pKD3为模板，用pgpA-H1和pgpA-H2引物扩增出带有同源臂的氯霉素抗性基因，两端带有FRT位点，如图2(a)所示；(2)利用L–阿拉伯糖诱导菌体内的质粒pKD46，使其表达Gam、Beta、Exo三种重组蛋白，并制备成感受态细胞，将上步得到的同源线性片段电转化入此感受态细胞中，碱性片段上的同源臂与基因组上的同源区域互相识别，如图2(b)所示；(3)线性片段上的同源臂与基因组上的同源区域同源重组，如图2(c)所示，用引物pgpA-out1和pgpA-out2鉴定发生同源重组的菌株；(4)将质粒pCP20电转化入发生同源重组的菌体后，42,℃诱导其表达FLP重组酶，此酶将FRT位点间的序列及1个FRT位点切除，如图2(d)，用pgpA-out1和pgpA-out2鉴定基因组上抗性基因切除的菌株．

1.2.2 磷脂的提取

取稳定期的菌液离心，用生理盐水洗涤3次，置于冷冻干燥机，－70,℃干燥12,h，获得干菌体．按m(干菌体)∶V(提取液)＝1,g∶1,mL的比例加入提取液(V(己烷)∶V(异丙醇)＝3∶2)，振荡或搅拌48,h后，离心，取上清液加入旋蒸仪，通氮气旋转干燥，干燥后，加入1,mL氯仿溶解提取出的总磷脂，取出再用氮气吹干即得总磷脂待测样品．

1.2.3 高效液相色谱法测定磷脂酰丝氨酸含量

高效液相色谱分析采用Venusil XBP C18色谱柱(250,mm×4.6,mm，5,µm)，柱温为31,℃，流量为1.0,mL/min，检测器为蒸发光散射检测器，检测波长为205,nm；流动相中V(85%磷酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)＝8∶46∶46．

将磷脂酰丝氨酸标准品溶于氯仿中配制成质量浓度分别为0.020,1、0.112,1、0.221,3、0.321,6、0.423,4,mg/mL的标准溶液，然后进行液相色谱分析．磷脂酰丝氨酸的出峰时间在3,min左右，如图3所示．以峰面积的对数(lg,A)对相应质量浓度的对数(lg,C)进行线性回归，可得线性回归方程lg,A＝3.005,2,lg,C＋7.592,2，R2＝0.999,1．

1.2.4 生长曲线的测定

用Bioscreen全自动生长曲线分析仪测定原始菌株E.,coli K12、出发菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重组菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)的生长曲线，每隔20,min测定2株菌在λ＝600,nm处的吸光度(A600)，绘制所得突变菌株的生长曲线．

2 结果与分析

2.1 E.,coli,K12(ΔpgpA,ΔpgpB,ΔsdaA,ΔsdaB)的构建(pgpA基因的敲除)

2.1.1 带有FRT位点的同源线性片段扩增

在E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)的基础上，敲除基因pgpA，首先要获得带同源臂的氯霉素抗性片段，两端带有FRT位点，以pKD3为模板，引物为pgpA-H1和pgpA-H2，所得PCR产物大小约为1,133,bp，如图4(a)所示．

2.1.2 同源重组后转化子的筛选

将得到的抗性基因线性片段电转化入上述经诱导含有重组酶的感受态细胞内．经氯霉素抗性平板筛选抗性菌株，并用引物pgpA-out1和pgpA-out2对筛选得到的菌株进行菌落PCR鉴定，pgpA基因全长519,bp，由于验证引物的位置处于同源臂的外围，因此，出发菌株验证引物间的大小应为1,035,bp，而发生同源重组后的菌株，其验证引物间的大小应为1,549,bp．如图4(b)所示，条带与预期相符，说明同源重组获得成功．

2.1.3 切除氯霉素抗性基因的验证

鉴定成功的阳性菌株经42,℃培养，使温敏质粒pKD46丢失．然后，将另一温敏质粒pCP20转入此重组菌株中，在30,℃下用氯霉素和氨苄青霉素的双抗性平板筛选．42,℃诱导FLP重组酶表达，挑取普通LA平板上长出的菌落，用引物pgpA-out1和pgpA-out2对丢失质粒pCP20的单菌落进行菌落PCR验证，出发菌株验证引物间的大小应为1,035,bp，而抗性基因切除后的菌株，其验证引物间的大小应为611,bp．结果如图4(c)所示，待鉴定菌株有1条大于500,bp的条带(泳道4)，对照菌株1,000,bp附近有1条带(泳道5)，与预期相符，说明抗性基因切除成功，得到菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB)．

2.2 E.,coli,K12(ΔpgpA,ΔpgpB,ΔsdaA,ΔsdaB,ΔtdcG)的构建(tdcG基因的敲除)

按照与1.2.1类似步骤验证tdcG基因的敲除，用含有50,bp同源臂的引物tdcG-H1和tdcG-H2扩增两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因，所得PCR产物大小为1,133,bp，如图5(a)所示(泳道1)．

线性片段与基因组发生同源重组后，用引物tdcG-out1和tdcG-out2对筛选得到的氯霉素抗性菌株进行菌落PCR鉴定，如图5(b)所示．出发菌株验证引物间的大小应为1,801,bp，而发生同源重组后的菌株，其验证引物间的大小应为1,585,bp．从泳道2、3可以看出，待鉴定菌株有1条略大于1,500,bp的条带，对照菌株有1条处于1,500,bp和2,000,bp的条带，与预期相符，说明同源重组获得成功．

抗性基因切除后，用引物tdcG-out1和tdcG-out2进行菌落PCR验证，结果如图5(c)所示．出发菌株验证引物间的大小应为1,801,bp，而抗性基因切除后的菌株，其验证引物间的大小应为647,bp．图5(c)中对照菌株有1条位于1,500,bp和2,000,bp的条带(泳道4)，待鉴定菌株有1条处于500,bp和750,bp的条带(泳道5)，与预期相符，说明抗性基因切除成功，获得菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)．

2.3 磷脂酰丝氨酸含量分析

原始菌株、出发菌株和重组菌株中磷脂酰丝氨酸的含量见表2．由表2可以看出：出发菌株比原始菌株中PS的积累量提高了约1倍，为1%，继续敲除磷脂酰甘油磷酸酶基因pgpA时，菌株的PS积累量提高为1.5%；继而敲除L–丝氨酸脱氨酶tdcG时，PS的产量可获得进一步提高，最高能达到2.5%左右.

2.4 磷脂酰丝氨酸的积累对生长情况的影响

在400,µL的LB培养基中，培养原始菌E.,coli K12、出发菌E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重组菌E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)并绘制出各个菌株的生长曲线，如图6所示．由图6可以看出：在稳定期，菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)的菌液吸光度均明显低于原始菌株E.,coli K12，且E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和E.,coli K12((ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)不再有二次生长现象．分析其原因是：sdaA、sdaB、tdcG基因的敲除阻断了L-丝氨酸脱氨为丙酮酸的途径，导致菌体内丙酮酸合成速率受到一定影响；同时，pgpA、pgpB基因的敲除影响心磷脂的合成，从而主要减弱线粒体膜的合成，使菌体生长受到抑制．

3 结 论

本文利用Red重组系统对大肠杆菌磷脂相关代谢途径进行改造，获得重组菌株E.,coli K12(ΔpgpA

ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)，成功阻断L–丝氨酸的分解代谢和磷脂酰甘油磷酸的部分代谢．将原始菌株E.,coli K12、出发菌株E.,coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)和重组菌株E.,coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)进行摇瓶发酵，发酵20,h后利用高效液相色谱分析菌体PS的含量，重组菌株PS在总磷脂的含量是出发菌株的2.5倍；但经途径改造后，菌株生长变缓，不再有二次生长现象，说明途径改造使PS积累的同时，导致菌体生长速度受到限制．实验表明，通过改造代谢途径可以提高PS在大肠杆菌中的含量，为大肠杆菌发酵制备PS奠定了基础．

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责任编辑：常涛

Effect of Gene pgpA and tdcG Knock-off on the Phosphatidylserine Biosynthesis in Escherichia coli

LIU Yihan，QIAO Jing，LI Yu，TONG Xinwei，LIU Xiaoguang，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Phosphatidylserine(PS)is an important active ingredient for medicine and food industry which could improve the cognitive ability and memory. In order to improve the content of PS inEscherichia coli, the Red recombinant system was used for deleting the gene pgpA and tdcG in E. coli K12(ΔsdaA ΔsdaB ΔpgpB)which can accumulate PS to block the L-serine degradation and cutting off the phosphatidylglycerophosphate catabolic pathway. After fermentation，the results showed that the total PS phospholipids synthesized by the mutant strain E. coli K12(ΔpgpA ΔpgpB ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG)was 2.5% which was 1.5 times higher than that in the starting strain(1%).

phosphatidylserine；Escherichia coli；gene knock-off；metabolic

Q784

A

1672-6510(2014)06-0001-06

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.001

2014–04–15；

2014–06–15

国家自然科学基金资助项目(21076159)；国家高技术研究发展计划“863计划”资助项目(2012AA022108)

刘逸寒（1982—），男，天津人，副教授；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.