大豆分子设计育种研究进展与展望

，，

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 大豆分子设计育种重点实验室,吉林 长春 130102;2.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 大豆分子设计育种重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150081)

0 引 言

大豆是世界上重要的粮油作物，是人类优质蛋白的主要来源，为全世界提供了30%的脂肪和60%的植物蛋白质来源。大豆起源于中国，在18世纪由我国传至西方。1938年以前，我国大豆种植面积居世界第一，产量接近世界的90%。在1952年，我国大豆产量仍占世界的50%左右。第二次世界大战后，世界上对植物油及饲用蛋白的需求急剧增加，世界大豆生产获得飞跃发展。但近几十年来我国大豆生产发展缓慢，总产量徘徊不前，目前的总产量仅为世界大豆产量的4%左右。而随着我国人民生活水平的提高，对大豆的需求急剧增加，供需矛盾日益突出。为满足国内市场需要，自1995年起我国开始进口大豆，进口量逐年攀升，据国家统计局数据显示，目前大豆的进口量已达总需求量的80%。中国大豆生产发展缓慢的主要原因是单产水平低，种植效益低于玉米、水稻等作物，导致种植面积的持续下滑；同时，由于国产大豆含油量低于进口大豆，致使大豆压榨企业更趋向于选择加工效益更高的进口大豆。

长期以来，利用常规育种方法，我国已培育出的1000余个大豆品种，为保障国家的需求做出了重要的贡献。但随着重要基因资源的逐步挖掘，利用传统育种的方法进行新品种选育的困难越来越多；同时，传统育种易受不良基因连锁的影响，育种效率较低，周期长，需要进行育种技术的升级改进。目前分子标记辅助育种技术在国内外大豆育种实践中得到了广泛的应用，转基因育种技术在国内外大豆育种实践中也取得了巨大的成就，转基因大豆已经成为世界上种植面积最大的转基因作物。

随着全基因测序技术的飞速发展和植物功能基因组研究的巨大进步，作物品种分子设计育种技术已经在水稻等作物上取得了长足的发展，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向，也成为推动世界大豆生产的重要手段。2010年大豆全基因组测序完成后，大豆功能基因组学的研究呈现突飞猛进的局面，为大豆分子设计育种研究提供了优良的基因资源，为大豆分子设计育种真正成为提升大豆育种水平的手段奠定了基础。本文主要对目前国内外大豆分子设计育种的研究进展进行比较，分析未来大豆分子设计育种研究发展的趋势，以期为推动我国大豆分子育种工作提供参考。

1 大豆分子设计育种研究现状

利用设计的手段进行育种是育种科学家一直追求的目标。荷兰科学家Peleman和Van der Voort在2003年首次比较全面地提出了作物品种分子设计育种的内涵和策略[1]，随后被逐渐广为接受并在近年被不断的完善[2-9]。分子设计育种的核心是基于对控制作物各种重要性状的关键基因及其调控网络的认识，利用生物技术等手段获取或创制优异种质资源作为分子设计的元件，根据预定的育种目标，选择合适的设计元件，通过系统生物学的手段，实现设计元件的组装，培育目标新品种。对于作为分子设计育种关键的设计元件的认知，随着研究的深入在不断的发展，由最初的QTL逐步向基因片段、分子模块和基因转变，相信随着对于控制作物性状基因方式认识的深入，将会最终实现在基因调控网络层次上的解析。

与其他的育种技术相比较，分子设计育种将实现在基因水平上对农艺性状地精确调控，解决传统育种易受不良基因连锁影响的难题，大幅度地提高育种效率，缩短育种周期。与分子标记辅助育种技术相比较，其精准性和可控性极大提升；转基因育种技术将会在分子设计育种研究中得到充分利用，以基因调控网络为基础的多基因叠加和整合转基因技术将会发挥更为充分的作用。

我国科学家在作物分子设计研究的理论和实践上均取得了重要的研究成果。万建民[10-11]，钱前[12]，黎裕[13]，王健康[13-14]等对于分子设计育种的研究理论和步骤进行了系统论述：认为分子设计育种是通过多种技术的集成与整合，对育种程序进行模拟和优化，提出最佳的符合育种目标亲本选配和后代选择策略，以提高作物育种的预见性和育种效率，实现经验育种向高效精确育种的转化。分子设计育种的研究包括研究目标性状的控制基因以及这些基因间的相互关系、根据不同生态环境条件下的育种目标设计目标基因型和根据选育目标基因型的途径分析制定品种育种方案三大步骤。目前我国科学家在水稻产量、水稻株型设计、水稻的品质设计等研究上取得了很大的进展[11,15-20]。最近，中国科学院薛勇彪、种康等人提出了“分子模块设计育种”的新型育种理念，其核心是解析功能基因及其调控网络的可遗传操作的功能单元(分子模块)，采用计算生物学和合成生物学等手段将这些模块有机耦合，系统地发掘分子模块互作对复杂性状的综合调控潜力，实现模块耦合与遗传背景及区域环境三者的有机协调统一，发挥分子模块群对复杂性状最佳的非线性叠加效应，从而有效实现复杂性状的定向改良[16,21]。这些理论的提出对于丰富和发展作物分子设计理论具有重大的推动作用。相信相关项目的启动，将会使我国的作物育种水平获得一个质的飞跃。

我国大豆分子育种的研究工作主要集中在分子标记辅助育种、新基因挖掘方面以及转基因技术和转基因品种的开发研究上。目前，已经开发和鉴定了多个与产量、发育、品质、抗病和抗逆等性状相关的新的分子标记和QTL；克隆了与光周期反应、共生固氮、产量、品质及抗逆性相关的多个基因；获得了一批具有抗虫、耐除草剂等的转基因大豆新品系和种质。邱丽娟、蒋炳军和曲梦楠等对于此领域的研究已做了专门的论述[22-27]，本文不再赘述。大豆的基因组复杂，大部分的基因组可能经历了四倍体化，使得大豆分子设计育种的研究相对滞后于水稻等作物。2010年大豆基因组测序的完成[28]，极大地推动了大豆分子设计育种的研究，国内外相关的研究开始进入了迅速发展阶段，特别是在全基因组水平上解析大豆重要农艺性状的工作越来越多，大豆重要的生物信息学数据库在不断地完善，对于大豆重要农艺性状的分子设计研究工作也正在逐步地展开[29-32]。

2 基因组学研究在大豆分子设计育种中的应用

全基因组信息是开展分子设计育种的重要基石。大豆基因组序列草图的完成，使得在全基因组水平上开展分子设计育种工作成为可能，并成为目前大豆分子设计育种研究最为活跃的领域。2010年美国农业部、美国能源部联合基因组研究所和普渡大学等多家机构完成了大豆基因组序列草图的测定,证实大豆基因组约为1.1Gb，预测存在46 430个编码蛋白质基因，大豆基因组中包含有大量的重复序列，其中75%的基因存在多个拷贝,同时还发现了基因组的大量复制及“巢式”复制，复杂和庞大的基因组给基因芯片和生物信息学技术提出了极大的挑战[28]。2010年，香港中文大学、华大基因研究院、农业部、中国科学院等单位合作开展了“大豆回家”项目，研究人员运用新一代测序技术对17个野生大豆和14个栽培大豆进行了全基因组重测序，建立了高密度的分子标记图谱[33]。通过对野生大豆和栽培大豆进行组装，鉴定出了18万个两种大豆中的缺失变异(PAVs)，发现了栽培大豆中获得以及丢失的基因。韩国科学家在2010年发表了野生大豆IT182932株系的测定结果[34]，证实野生大豆与栽培大豆存在0.31%的差异(包括2.5 Mb的碱基替换和406 kb的小的插入和缺失)，野生大豆与栽培大豆的分化约出现在0.27 MYA，远早于6000年-9000年的人工驯化过程，因此在野生大豆中存在更加丰富的遗传多样性，为解决人类的选择造成的生物多样性变窄提供了良好的遗传资源。2014年7月，香港中文大学、深圳华大基因研究院等单位的科研人员联合完成了野生大豆W05的全基因组测序工作，从中发现了新的耐盐基因——GmCHX1，该基因能够在盐胁迫条件下维持较低的钠离子与钾离子比率，从而增强大豆的耐盐性[35]，这为通过解析野生大豆的优良性状实现品种改良提供了很好的借鉴。2014年10月，中国农业科学院作物科学研究所等多家单位完成了对选取来自东北、华北、黄淮、华南、日本、韩国及俄罗斯的7株地区代表性野生大豆品种的泛基因组测序，发现栽培大豆受选择的基因多与抗旱有关，而野生大豆中受选择基因则呈现多样化，不同地理区域来源的野生大豆受到了不同环境选择，从中鉴定出大量与重要农艺性状相关的基因和变异[36]，为分子设计育种提供了重要的基因资源。因此，在全基因组水平上进行大豆的分子设计育种工作将成为该领域最重要的研究内容之一。

利用遗传学和基因组学相结合手段分离大豆重要农艺性状相关重要基因的工作近年来也取得很快的进展，并在个别性状基因调控网的解析上取得了突破，为大豆分子设计育种提供了重要的分子元件。大豆的生育期(开花期与成熟期)是决定大豆产量的关键因素之一，其由控制大豆开花期和成熟期的多基因位点决定。经典遗传学研究发现了10个与开花期相关的基因，除与“长童期”相关的J位点外，其余习惯称为E系列(E1至E9)基因。迄今已明确E1、E2、E3、E4、E9和GmFTs等位点的功能基因，并进行了相关的功能验证，初步阐明了大豆生育期的基因调控网络[37-42]。研究发现，大豆生育期基因E1对大豆的开花期及成熟期的影响最大，是豆科植物特有的新转录因子，其含有一个双边的核定位信号(NLS)和DNA结合位点,并含有一个与B3远缘相关的结构域。E1的表达在短日照条件下受到明显抑制，与大豆为短日植物特性密切关联，处于开花期基因表达调控网络的中枢地位[37]。E2基因为GIGANTEA的同源基因，该基因对光周期反应影响较小，具有受外在的环境影响较小的特性，因此在育种实践上具有很广阔的应用前景[43]。E3基因为GmPhyA3，其受控于E1，在e1遗传背景下，E3的功能得不到充分发挥[39]。E4基因为光敏色素Phytochrome A基因3个拷贝之一GmPHYA2，e4基因型需在隐性e3基因型存在时，才导致光周期不敏感性。E9基因被精细定位到16号染色体上介于标记M5和M7之间的245 kb区间内，其中分子标记ID1的等位变异类型与F2群体的开花期及成熟期变化显著相关[40]。大豆FT基因的同源基因GmFT2a和GmFT5a被证明对大豆开花起主要促进作用[41,44-47]，GmFT4虽然属于FT家族蛋白，但功能与GmFT2a/5a相反，是大豆开花的抑制因子。大豆中开花抑制因子GmFT4与开花促进因子GmFT2a/5a之间的平衡，决定着大豆的开花与成熟[42]。同时，大豆光周期调控途径诸多调控因子的相关基因也已经被鉴定，详见夏正俊等的近期综述[48]，利用这些基因解析大豆生育期的工作已经逐步展开[36,49-51]，为大豆分子设计育种研究提供了很好的突破口。同时，大豆的株型控制基因、荚粒数基因、裂荚基因、结瘤基因、抗虫抗病基因、耐生物胁迫基因、种子脂肪酸组成和营养成分关键调控基因的研究也已取得重要进展，相关工作已有综述[23,24,26,52,53]，这些基因功能的鉴定为大豆分子设计育种研究的开展提供了重要基础。

3 转基因技术在大豆分子设计育种中的应用

转基因技术已经在大豆育种中取得了巨大的成功，以孟山都和先锋种业为代表的跨国公司在转基因大豆育种中已取得了显著成绩。转基因作物自商业化种植以来，转基因大豆的全球种植面积在转基因作物中处于领先地位。2103年，转基因大豆面积种植面积为8 450万hm2，占大豆全球总种植面积的79%，其中大豆主要生产国美国、巴西和阿根廷的转基因种植面积比例分别达到了93%、92%和100%。目前世界上批准商业化种植的转基因大豆转化体有25个，其中21个是抗除草剂转化体(含4个抗除草剂和其他性状的复合性状)，5个是与品质性状有关，3个是与抗虫性状有关(http://www.isaaa.org/)。新的转基因技术与产品也已经或即将推向市场，例如：孟山都公司2012年已推出第二代转基因耐草甘膦RR2 Yield大豆品种；先锋公司已推出对草甘膦有更高抗性的Optimum TMGATTM转基因大豆；拜耳公司也推出Liberty-link 抗除草剂转基因大豆品种[54-55]。利用转基因手段，聚合多个优良性状已是今后的发展趋势，该技术目前在第二代抗除草剂大豆、食用及饲用大豆、抗虫大豆、优质和高附加值大豆育种方面取得了长足进展，培育出高油酸等类型的转基因大豆品种[54-58]。我国科学家在抗逆、抗病虫、抗除草剂和品质改良转基因大豆育种方面也取得了一定的进展。利用农杆菌介导法和杂交转育技术将抗旱基因、耐盐碱基因、耐高温抗逆基因导入不同生态区大豆品种中，获得了一批抗逆转基因材料，完成了国家“中间试验”和“环境释放”，并获得 “环境释放”证书，为大豆转基因新品种产业化提供了重要材料[26,59-70]。

对于目标基因的定向遗传改良，是实现在基因水平上进行分子设计育种的理想手段。随着分子生物学技术的快速发展，基因的定向敲除技术逐步成熟，为大豆的定向分子设计育种提供了有力的手段。最近发展起来的锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)、转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effectors Nucleases,TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas system,CRISPR/Cas)等技术为基因定向遗传改造提供了强有力的工具[71-88]。锌指核酸酶(ZFNs)已经在大豆中成功的应用[89]，但由于脱靶效应严重，而且很难完全找到符合条件的匹配锌指结构，因而限制了该技术的发展和推广。目前已经利用TALENs技术对大豆两种脂肪酸去饱和酶(FAD2-1A、FAD2-1B)进行定点敲除，获得了不饱和脂肪酸改良的可遗传大豆种质，其油酸含量从原来的20%提高到80%，亚油酸含量从原来的50%下调为4%[90]，预测该类新技术将在大豆分子设计育种中发挥重要作用。与ZFNs 和TALENs相比，CRISPR/Cas 系统更简单，并且更容易操作。国内外的不少实验室已经开始尝试利用CRISPR/Cas系统对大豆的基因进行定向改造，其在今后的分子设计育种上具有巨大的潜力。

转基因大豆新品种的商业化种植及应用已成为全球化的发展趋势，今后随着更加安全的转基因技术和多基因定向改良技术的发展，转基因技术将在大豆分子设计育种上起到至关重要的作用。

4 系统生物学手段在大豆分子设计育种中的应用

要真正实现从基因水平到作物品种性状的分子设计，必须了解作物在基因、细胞、器官、个体到群体不同层次上的组织方式和调控规律，这需要对作物生长发育进行整体的研究。系统生物学作为在整体水平上研究生命现象的一门新兴科学，将在未来的分子设计育种上发挥更加重要的作用。系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科，从分子、细胞、器官到机体和从个体、群体到生态系统不同层次上进行生物信息的整合和定量化，将生物学由描述性的科学转变为可定量化和能预测的科学[91-92]。系统生物学从系统层次对生物系统的模拟和设计将为作物品种的分子设计提供理论基础，其利用基因组、转录组、蛋白组、代谢组和表型组等组学的海量数据，研究不同品种间的分子差异和影响，研究环境因素在不同品种间的作用过程，建立数学模型评估基因、蛋白质、代谢水平的变化和差异，阐明个体和群体的生物效应[91-94]。系统生物学的概念从Leroy Hood在2003年提出以来，很快被生物学界所接受，在药物的开发和疾病的诊治上取得很快的进展[95-98]，可以预期很快将会在植物学研究上有较大的突破。

目前，作为系统生物学重要组成部分的生物信息学已经在作物育种实践中得到了广泛的应用，成为新品种选育不可缺少的重要工具。国际上已经建立了多个大豆的数据库可用于大豆生物信息的分析研究，譬如：Soybase网站(http://soybase.ncgr.org/)是目前信息最为全面的大豆数据库，其中包括遗传图谱、基因、基因组序列、分子标记、QTL等信息；SFGD网站(http://bioinformatics.cau.edu.cn/SFGD/)提供了大豆多个大豆基因表达谱和转录组数据、基因的共表达调控网络和miRNA靶位点代谢途径的信息；Phytozome 网站(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)提供了大豆等多种植物的基因组信息；Soybean Proteome Database网站(http://proteome.dc.affrc.go.jp/Soybean/)提供了大豆蛋白质组，转录组和代谢组的数据；SoyMetDB网站(http://soymetdb.org/)提供了大豆代谢组的数据；国家大豆种质资源表型数据库(http://icgr.caas.net.cn/)提供了我国大豆种质资源的信息。这些数据库为大豆的分子设计育种提供了大量的信息资源，为大豆系统生物学研究奠定了基础。

目前国际上在农作物品质、组分、形态检测等方面大量采用了自动化技术，开发出多种植株田间综合性状检测设备，譬如，集脱粒、称重、测水分、包装于一体的现场快速测产系统，可以对种子表型进行高通量快速检测。有关跨国种子公司已经实现了从籽粒激光切削取样到DNA提取、引物加注、PCR扩增、生物信息读取、目标样品选择等的全程自动化。这种以性状和基因信息数据采集和处理分析为基础，对单粒种子表型定量化分析，基因型多位点分析，对于育种流程进行信息化管理的工作模式，已经显现出分子设计育种的雏形，为最终实现分子设计育种的目标提供了设备条件和信息化处理经验，相信随着系统生物学研究在基因-表型计算模型的不断完善，大豆的分子设计育种将成为现实。

5 展 望

目前，我国育成的大豆品种主要还是通过常规育种方法所获得；通过我国科学家的不懈努力，大豆分子标记辅助育种在我国已经得到快速发展，转基因育种也取得了长足的进步，这为大豆分子设计育种工作的开展提供了良好的基础。同其他作物一样，建立基因型-表现型的系统生物学模型是今后大豆分子设计育种的瓶颈。随着大豆基因组学研究的深入，基因型的大规模鉴定将会很快得到解决，在定量分析基础上的表型组学研究和各种育种计算模型的建立将会成为大豆分子设计育种的主要挑战。在今后相当长的一段时间内，我国的大豆育种将会处于常规育种和大豆分子标记辅助育种、大豆转基因育种以及大豆分子设计育种并存的局面，几种育种方式会被交互使用，相辅相成；而分子设计育种技术在大豆育种的作用将会不断地被认知，并在育种实践中发挥越来越重要的作用。

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