拮抗玉米茎腐病菌的放线菌菌株发酵产物理化性质研究*

翟贺玲，王艳红，高超，张波，何超

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆163319）

拮抗玉米茎腐病菌的放线菌菌株发酵产物理化性质研究*

翟贺玲，王艳红*，高超，张波，何超

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆163319）

本文通过纸电泳、pH层析等方法研究了拮抗玉米茎腐病菌的放线菌发酵产物的理化性质，同时也对其光稳定性、温度稳定性实验进行研究，明确该放线菌的发酵产物主要成分为水溶性的中性物质，且具有较好稳定性，这些理化性质的研究为其下游工艺特别是产物分离提取方法的选择提供理论依据。

玉米茎腐病菌；放线菌；发酵产物；理化性质

玉米茎腐病（Corn stalk rot）是我国玉米生产上的一类重要病害，也是世界玉米产区普遍发生的一种土传病害[1]，其发病率一般在15%～20%，严重时可达70%以上[2]。因此，从生物防治角度考虑，广谱高效的生防菌剂亟待开发。目前，放线菌是应用最广的生防微生物之一，其在多个领域得到广泛应用，如医药领域、农业领域[3]。菌株YH-1是黑龙江八一农垦大学过程工程教研室从土壤中分离到的一株生防放线菌菌株，该菌株对玉米茎腐病（Corn stalk rot）有较强的拮抗作用。本实验主要对其发酵产物进行纸电泳、pH层析以研究其理化性质，同时也对其发酵产物进行光稳定性、热稳定性，溶解度等进行相关实验，以期为该菌株的进一步研究，特别是下游工艺发酵产物分离提取方法的选择提供参考，更期待为该菌株早日实现产业化奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及所用试剂和实验器材

放线菌菌株YH-1，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），均由黑龙江八一农垦大学过程工程教研室提供。

所用试剂均为分析纯；所用主要实验器材：电泳仪、微量进样器、水平电泳槽、层析缸、无菌玻璃板等。

1.2 稳定性实验

1.2.1 温度稳定性实验将放线菌菌株YH-1的发酵液放在50、4、-20℃放置20d，对照为室温放置的发酵液，管碟法测定生物活性[4]。重复3次。

1.2.2 光稳定性实验将放线菌菌株YH-1的发酵液在紫外光下分别照射2和4h，对照为未进行紫外光照处理，管碟法测定生物活性[4]。重复3次。

1.3 纸电泳实验

采用新华1号中速滤纸顺着纸纹方向裁成32cm×0.6cm的滤纸条，用微量进样器吸取放线菌

2 结果与分析

2.1 温度稳定性实验

将放线菌菌株YH-1的发酵液分别放在不同温度：50、4、-20℃保存20d，管碟法测定抑菌活性，3次重复。

表1 温度对YH-1发酵液活性的影响Tab.1 Effects of tempreture on fermentation activity of YH-1

从表1可以看出，冷冻效果最好，抑菌圈直径的平均值27.2mm,其他温度处理后抑菌圈直径的平均值分别为26.1、26.7、27.2mm，与对照27.0mm相比，活性几乎没有降低，因此，放线菌菌株YH-1的发酵液具有很好的温度稳定性。菌株YH-1的发酵液10μL在滤纸中央点样。在电泳槽的两端贮液槽内分别加pH值为4和pH值为8的Na2HPO-4柠檬酸缓冲液，用缓冲液均匀湿润滤纸条但点样处勿浸入，标记正负极，盖好电泳槽盖，并做好降温处理。先在50V电压下预电泳30min，再在150V的电压下电泳1h，然后将电压调到350V，继续电泳2h后终止，取出晾干，生物显影，对YH-1发酵产物性质进行判断[5]。

1.4 极性和溶解度实验

极性和溶解度实验主要采用Betina[6]溶剂系统进行，此溶剂系统包括：水；水饱和的苯；水饱和的正丁醇及水饱和的乙酸乙酯。

试验方法：取放线菌菌株YH-1的发酵液10μL点样于新华一号滤纸上，上行展开，展开距离15cm，完毕后将纸条吹干，紫外线灭菌，生物显影并测量Rf值[7]。

1.5 pH层析试验

对放线菌菌株YH-1的发酵液采用pH层析法[5]进行酸碱性和离解度的测定。具体方法如下：

取新华一号中速滤纸，顺着滤纸纸纹方向裁成长17cm、宽0.6cm的9条滤纸带，然后将各滤纸条用不同pH值的缓冲液处理，晾干，点样10μL，在70%乙醇溶剂中上行展层，展开距离为15cm，完毕后将滤纸条吹干，紫外线灭菌，生物显影并测量Rf值[7]。

2.2 光稳定性实验

将放线菌菌株YH-1的发酵液经紫外线照射2和4h后，管碟法测定生物活性，结果见表2。

表2 光照对YH-1发酵液活性的影响Tab.2 Effects of different time on fermentation activity of YH-1

从表2可以看出，紫外光照射处理与同时段对照相比，活性几乎没有改变，存活率分别为98.5%和97.1%。这表明该菌的发酵液具有光照稳定性的特点，可以进一步应用。

2.3 纸电泳实验

放线菌菌株YH-1的发酵液分别在酸性（pH4）和碱性（pH8）的缓冲液中进行电泳，多次电泳结果表明，电泳时发酵产物没发生任何移动，仍在在点样点处（表3），说明该发酵产物是中性物质，此结果为下游工艺提供依据。

表3 YH-1发酵液的纸电泳结果Tab.3 Effects of paper electrophoresis of YH-1 fermentation

2.4 极性和溶解度实验

采用Betina溶剂系统进行极性和溶解度实验，放线菌菌株YH-1发酵液在此溶剂系统中的Rf值见表4。

表4 YH-1发酵液在Betina溶剂系统中的Rf值Tab.4 Rfvalue of YH-1 fermentation in Betina solvents

从表4可以看出，该发酵液的活性成分在水中的R f值最大，在水饱和的苯和乙酸乙酯溶液中，活性组分没有任何移动，说明该活性组分在水中的溶解度较好，在有机溶剂中溶解较少或者不溶解，因此，将活性组分鉴定为水溶性的抗生素。

2.5 pH层析试验

根据Betina溶剂系统的实验结果，放线菌菌株YH-1的发酵液由于其发酵产物具有极性较强的特点，经不同pH处理后，我们选择70%乙醇溶剂展层，图谱见图1。

图1 pH层析结果Fig.1 Results of pH chromatography

结果表明无论在在酸性区间还是在碱性区间Rf值基本在同一位置，基本没有改变，与经典抗生素图谱相比，其pH层析图谱为中性抗生素图谱，因此推断其活性组分为中性物质，此实验结果与纸电泳的实验结果一致，均证明菌株YH-1的发酵液活性组分为中性物质。

3 结论

放线菌菌株YH-1的发酵液经对其理化性质进行研究，发现其稳定性较好，无论高温处理还是低温贮藏该发酵液仍保持很高的活性，对光不敏感，见光不易分解，因此，该发酵产物可开发成符合人们需要的、具有生防潜力的农用抗生素，满足人们对绿色产品的需求，在植物病害的田间防治上起到积极作用，具有较好的应用价值和前景[8]。

对于放线菌菌株YH-1的发酵液的理化性质进行研究，本研究主要进行的纸电泳实验，生物显影结果表明活性组分电泳时不向正负极移动，只在点样点处，可推断其活性组分为中性抗生素；采用Betina溶剂系统进行的纸层析试验明确了该放线菌发酵产物的有效组分极性较强，推测其属于中性的水溶性抗生素，在有机溶剂中不溶解或者溶解较少；对其进行的pH纸层析试验明确了YH-1发酵产物的有效组分在无论在酸性条件还是在碱性条件下其Rf值基本没用变化，在约在同一条直线上，也就是说Rf值不受pH值的影响，进一步证明YH-1的发酵产物为中性物质。因此，通过对放线菌菌株YH-1发酵液理化性质的研究已明确其活性组分为中性物质，此性质又与刘秋等[9]的龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06相似，为下游工艺选择分离方法提供理论依据，但二者的主要化学成分的化学结构、抗菌作用机制等方面是否相似还有待于进一步研究。

［1］吴海燕,孙淑荣,范作伟,等.玉米茎腐病研究现状与防治对策［J］.玉米科学,2007,15（4）:129-132.

［2］陈润玲，檀尊社,赵保献,等.玉米茎腐病研究进展［J］.西北农业学报，2005,14（6）:157-160.

［3］姜钰,董怀玉,徐秀德,等.放线菌在植病生防中的研究进展［J］.杂粮作物,2005,25（5）:329-331.

［4］田小卫.一株放线菌次生代谢产物抗菌活性的初步研究［J］.植物保护,2004,30（2）：51-53.

［5］周德庆.微生物学实验手册［M］.上海：上海科学技术出版社, 1997,339-345.

［6］丁立孝,王新,王东昌,等.农用抗生素对烟草赤星病防治效果的研究［J］.吉林农业大学学报,1999,21（2）：16-19.

［7］徐娇,许文超,康占海,等.瓜果腐霉除草活性成分的分离鉴定［J］.中国农业科学,2009,42（6）:1994-2001.

［8］王燕,宗兆锋,程联社.放线菌在植物病害生物防治中的应用［J］.杨凌职业技术学院学报,2005，4（3）:21-23.

［9］刘秋,吴元华,于基成.龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抑菌活性组份SN06的分离纯化［J］.植物保护学报,2004,31（4）:353-358.

Researching physico-chem ical properties of fermentation substance of the streptomycetes rivalrying corn stalk rot*

ZHAIHe-ling，WANG Yan-hong，GAO-Chao，ZHANG Bo，HE Chao
（Life Science and Technology College of Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Physico-chemical properties of fermentation substance of the streptomycetes rivalrying corn stalk rot were researched through paper electrophoresis and pH chromatography.At the same time,light stability and heat stability were also researched.The results showed that the fermentation substance was identified neutral and easily soluble in water.It had well stabilization.These properties had provided theory bases for downstream technology especially for separation and extraction methods.

corn stalk rot；actinomycete；fermentation substance；physico-chemical properties

Q935

A

1002-1124（2014）07-0007-03

2014-04-04

黑龙江八一农垦大学“大学生创新创业训练计划”项目（xc2 013056）

翟贺玲（1990-），女，2010级生物技术专业本科生。

王艳红（1979-），女，讲师，硕士，毕业于沈阳农业大学，现主要从事微生物药物相关的教学与科研工作。