Serratia marcescens H30脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质

徐晶晶，苏二正，吴向萍，马昱澍，魏东芝

(1.华东理工大学鲁华生物技术研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海200237；2.南京林业大学轻工科学与工程学院酶与发酵工程实验室，南京210037)

Serratia marcescens H30脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质

徐晶晶1，苏二正2，吴向萍1，马昱澍1，魏东芝1

(1.华东理工大学鲁华生物技术研究所生物反应器工程国家重点实验室，上海200237；2.南京林业大学轻工科学与工程学院酶与发酵工程实验室，南京210037)

为了提高SerratiamarcescensH30脂肪酶的可溶表达水平，分别将目的基因与pGEX-4T-1、pET28a和pET32a构建重组表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)，通过优化诱导过程，发现可溶性酶的最高活性可达25 000 U/L。再经Ni2+亲和柱纯化、LH-EP固定化后，固定化酶的比酶活为214 U/g(以1 g湿质量计)，酶活回收率为51%。固定化后重组脂肪酶的最适温度由30 ℃提高到35 ℃，最适pH从7.0偏移至8.0左右，并且稳定性也有所增加。该固定化重组脂肪酶同样能够拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，光学选择性没有改变。反应14 h，转化率为48.5%，底物的e.e.值为99.2%，表明该固定化脂肪酶能有效拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。

黏质沙雷氏菌；脂肪酶；可溶表达；固定化；手性拆分

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，它可将中长链甘油三酯催化水解成甘油和脂肪酸。除水解反应以外，脂肪酶还能催化酯化、酯交换、氨解、醇解等多种反应，并且在非水相体系中具有高度的区域选择性和立体选择性。因此，脂肪酶在食品工业、医药化妆品、生物柴油、手性化学品拆分制备方面发挥着重要作用[1-2]。

与其他细菌脂肪酶相比，来源于黏质沙雷氏菌的脂肪酶因能高立体选择性催化拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯((±)-MPGM)，得到冠状血管舒张剂药物顺式地尔硫卓制备的关键中间体 (2R,3S)-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯，即(-)-MPGM而备受关注[3-4]。Idei等[5]克隆得到黏质沙雷氏菌Sr41 8000的脂肪酶基因，并将其与信号肽共同构建到载体pUC19上再转化到野生型菌株中进行表达，使酶产量增加了近140倍，之后又使用膜反应器对该脂肪酶固定化，并用于拆分消旋体(±)-MPGM。目前，人们已经从黏质沙雷氏菌中克隆该脂肪酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，但大多数表达产物都以无活性的包涵体形式存在[6-8]。因此，如何实现该脂肪酶的高水平活性表达是一个亟待解决的难题。一般可以通过2种途径来实现：一是对重组脂肪酶包涵体进行变复性以重新获得有活性的酶，但这种方法由于操作繁琐、耗时较长不能用于工业化生产；二是构建能可溶表达该脂肪酶的表达系统或通过优化目的蛋白的表达条件，实现可溶活性表达。

SerratiamarcescensH30为华东理工大学鲁华生物技术研究所筛选获得的1株高产2,3-丁二醇菌株，笔者以SerratiamarcescensH30基因组为模板克隆获得其脂肪酶基因，构建多个原核表达系统，以可溶性表达为目的优化其表达条件， 随后对该脂肪酶进行纯化、固定化，并研究其理化性质，为地尔硫卓规模化生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和材料

菌株E.coliDH5α、E.coliBL21 (DE3)、SerratiamarcescensH30、表达载体pGEX-4T-1、pET28a、pET32a均为华东理工大学鲁华生物技术研究所保藏；质粒PMD19-T购自TaKaRa公司； Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA Marker购于上海捷瑞生物工程有限公司；聚乙烯醇、橄榄油均购于中国医药(集团)上海化学试剂公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素购于Sigma公司；其他生化试剂均为市售国产分析纯。

1.2 脂肪酶基因的克隆和表达

根据GenBank上提交的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因设计并合成特异性引物，正向引物5′-G￣G￣T￣T￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣G￣G￣C￣A￣T￣C￣T￣T￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣T￣A￣A￣G￣G￣A-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)，反向引物为5′-C￣C￣T￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣A￣C￣C￣T￣G￣A￣T￣C-3′ (下划线为NotⅠ酶切位点)，以黏质沙雷氏菌H30基因组为模板进行PCR扩增。将PCR产物连接到pMD19-T载体并测序。把经测序验证的重组质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后电泳回收DNA片段，用T4DNA连接酶连接到同样经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的pET28a、 pET32a和pGEX-4T-1中，构建表达质粒,转化大肠杆菌DH5α，经双酶切、测序验证正确后，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行初步表达。在LB培养基(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0)中，37 ℃、200 r/min培养至OD 为0.6～0.8左右，加入0.1% (体积分数) 1 mol/L的诱导剂IPTG于30 ℃培养8 h后离心收集菌体。将菌体重悬于25 mL 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液中，超声波破碎菌体后高速离心，对上清与沉淀分别取样，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.3 脂肪酶的酶活测定

脂肪酶的活力测定以橄榄油为底物采用NaOH滴定法[9]。0.5 mL适当稀释的酶液或10～50 mg固定化酶、100 mmol/L pH 7.0的磷酸钠缓冲液2.0 mL的测酶活体系于摇床上30 ℃保温5 min左右，加入预保温的乳化橄榄油底物2.5 mL开始反应，10 min后用10 mL终止液(无水乙醇与丙酮按照体积比1∶ 1混合)终止反应，对于游离酶空白对照中先加终止液再加底物，对于固定化酶空白对照中加终止液后煮沸10 min再加底物。脂肪酶催化橄榄油水解产生的游离脂肪酸的量通过50 mmol/L的NaOH滴定测得，加2滴0.05%(质量分数)酚酞指示滴定终点。在上述条件下，脂肪酶水解底物每分钟产生1 μmol游离脂肪酸所需的酶定义为一个活力单位(U)。

1.4 重组脂肪酶的分离纯化

用镍柱对重组脂肪酶进行分离纯化。离心收集50 mL 发酵液的菌体，重悬于25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液中，超声波破碎菌体，高速离心分离上清和沉淀；将上清5 mL以1.0 mL/min 的速度加样到柱体积为1 mL的Ni-NTA Sepharose 亲和柱上，基本流动相为含200 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 缓冲液；用20 mmol/L咪唑进行冲洗，穿出峰过后，用浓度梯度为50、80、100和200 mmol/L的咪唑流动相洗脱，分别收集洗脱组分进行SDS-PAGE电泳分析。

1.5 脂肪酶的固定化

称取0.5 g环氧载体LH-EP加入5 mL纯化的脂肪酶溶液中。在25 ℃和200 r/min下开始固定化。16 h后，用砂芯漏斗滤出固定化酶，用去离子水充分清洗并过滤抽干。测定固定化溶液中的蛋白浓度及固定化脂肪酶的活力，计算固定化率及酶活力回收率。

称取2.5 g 氨基载体LH-HA，加入10 mL pH 8.0的0.02 mol/L的磷酸钾缓冲液(含有2.0% (体积分数)的戊二醛)中，在25 ℃ 和200 r/min下活化2 h，活化结束后用去离子水充分清洗直至闻不出戊二醛味。称取0.5 g 活化的氨基载体LH-HA，按照环氧基载体同样的方法进行固定化。10 h后，用砂芯漏斗滤出固定化酶，并依次用去离子水、1 mol/L的NaCl溶液、0.02 mol/L pH 8.0的磷酸钾缓冲液充分清洗，过滤抽干。测定固定化溶液中的蛋白浓度及固定化脂肪酶的活力，计算固定化率及酶活力回收率。

1.6 脂肪酶的性质研究

1)最适温度 取适量的纯化脂肪酶液或固定化脂肪酶，分别于25～60 ℃下测定酶活。将最适温度下的酶活定义为100%，计算相对酶活。

2)最适pH 取适量的纯化脂肪酶液或固定化脂肪酶，在30 ℃下分别于pH 3.0～10.0的磷酸-硼酸-柠檬酸缓冲液中测定酶活。将最适pH下的酶活定义为100%，计算相对酶活。

3)热稳定性 取适量的纯化脂肪酶液或固定化脂肪酶，加入5 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，置于不同温度(25～60 ℃)下,保温6 h后，测定残余酶活。

4)pH稳定性 取适量的纯化脂肪酶液或固定化脂肪酶，置于25 mL的具塞三角烧瓶中，依次加入5 mL、pH 3.0～10.0的磷酸-硼酸-柠檬酸缓冲液， 于25 ℃放置12 h后，测定残余酶活。

1.7 固定化脂肪酶拆分地尔硫卓中间体

在25 mL具塞三角瓶中加入5 mL甲苯，5 mL Tris-HCl缓冲液(200 mmol/L，pH 8.0)，100 mmol/L (±)-MPGM，0.1 g 固定化脂肪酶，置于30 ℃的恒温摇床150 r/min进行反应，一定时间后取样,10 000 r/min离心10 min，分离有机相和水相，取有机相进行HPLC检测。手性柱为日本大赛璐公司的Chiralcel OJ，流动相为正己烷-异丙醇混合液(两者体积比为60∶ 40)，柱温控制在20 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长254 nm。

2 结果与讨论

2.1 H30脂肪酶的克隆与表达

以S.marcescensH30的基因组DNA为模板，通过PCR(94 ℃ 0.5 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环)获得2 000 bp左右的扩增产物，与预期的目的基因大小相符。将PCR获得的脂肪酶基因片段经胶回收纯化后，与pMD19-T载体连接过夜，转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组子经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定正确的重组菌送样测序，测序结果经BLAST进行同源性比对分析，与GenBank中已提交的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因同源性为98%。

将成功构建的重组质粒pET28a-lipase、pET32a-lipase和pGEX-4T-1-lipase分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达。在30 ℃条件下，IPTG诱导8 h后，收集菌体超声破碎后离心，所得的上清液与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示。由图1可知：重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase中脂肪酶主要以非可溶性包涵体形式表达为主(图1(a)泳道5)，重组菌E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-lipase的表达产物中，脂肪酶的可溶表达与包涵体约各占一半(图1(c)泳道4和5)，而重组菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase中脂肪酶主要以可溶性表达为主(图1(b)泳道4)。就脂肪酶在重组菌中的表达量而言，重组菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase和E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase中脂肪酶的表达总量较高，而E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-lipase中的脂肪酶表达量较低。

1—空载体空白对照; 2—诱导前空白对照; 3—诱导后全菌体; 4—诱导后上清; 5—诱导后沉淀; M—标准蛋白图1 大肠杆菌重组S.marcescens H30脂肪酶的诱导表达Fig.1 Recombinant expression of S.marcescens H30 lipase in E.coli

测定重组菌表达脂肪酶的比酶活表明：重组菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase表达脂肪酶的比酶活最高，达到5 000 U/L；重组菌E.coliBL21(DE3)/ pGEX-4T-1-lipase表达脂肪酶比酶活次之，达到2 000 U/L；重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase表达脂肪酶比酶活最低，仅为500 U/L左右。原始S.marcescensH30表达的脂肪酶比酶活为400 U/L左右，可以看出在大肠杆菌中重组表达后，脂肪酶的表达酶活都有了不同程度的提高。

结合重组菌中脂肪酶的表达状况及其表达酶活，后续表达条件优化以重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET32a-lipase作为研究对象。

2.2 表达条件优化

为了获得更理想的表达结果，在LB培养基中对重组菌E.coliBL21(DE3)/ pET32a-lipase的诱导表达条件如诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导时间等进行了优化。得到重组脂肪酶诱导表达的最佳条件：25 ℃，IPTG浓度0.8 mmol/L，诱导时间为12 h。同时，发现添加诱导剂IPTG的同时，添加终浓度为5 mmol/L的CaCl2，能使脂肪酶的表达活力提高1.6倍(图2)。在最优条件下诱导表达，重组菌OD600最高达到16.2，脂肪酶比酶活达到25 000 U/L(图3)，比文献[6-8]报道的结果要高。

图2 Ca2+浓度对E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase 重组脂肪酶诱导表达的影响Fig.2 Effects of Ca2+ concentration on lipase expression of E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase

图3 E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase重组脂肪 酶诱导表达进程曲线Fig.3 Time courses of recombinant lipase expression in E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase

2.3 重组脂肪酶的纯化

利用pET32a 融合表达在目的蛋白的C末端的His-tag，通过Ni2+亲和柱进行分离纯化。SDS-PAGE电泳结果见图4。由图4可知：采用80 mmol/L以上浓度的咪唑能获得纯度较高的目的蛋白。但同时考虑到过高的盐浓度会降低脂肪酶的活性，所以选用80 mmol/L咪唑作为纯化该脂肪酶时的洗脱浓度。

1、2—50 mmol/L 咪唑洗脱峰；3、4—80 mmol/L咪唑洗脱峰；5、6—100 mmol/L咪唑洗脱峰 7—200 mmol/L咪唑洗脱峰图4 咪唑洗脱浓度对纯化脂肪酶影响Fig.4 Effects of imidazole concentration on purification of lipase

2.4 重组脂肪酶的固定化

为了寻找对重组脂肪酶固定化效果较好的载体，考察氨基载体和环氧载体对脂肪酶的固定化效果，结果见表1。由表1可知：环氧载体LH-EP的固定化率为76%，酶活回收率为51%，最终固定化酶比酶活达到214 U/g(以1 g菌体湿质量计)；氨基载体LH-HA对蛋白的固定化率以及酶活回收率均不高，分别为63%和23%，最终的固定化酶比酶活也仅达到103 U/g。由此可以看出LH-EP是一个较适宜的固定化载体。

表1 不同固定化载体对脂肪酶的固定化效果

2.5 重组脂肪酶的酶学性质

考察纯化的游离脂肪酶及环氧载体LH-EP固定化脂肪酶的最适反应温度，结果见图5。由图5可知：固定化后脂肪酶的最适水解温度与游离酶相比从30 ℃提高到35 ℃。当温度升至45 ℃时，游离酶活性显著下降，与之相比固定化酶则保留约60%的活性。当温度升高至50 ℃以上后游离酶和固定化酶都迅速失活。

图5 重组脂肪酶的最适温度Fig.5 Optimal temperature of recombinant lipase

pH是影响酶催化活性的主要因素之一，因此考察pH对重组脂肪酶活力的影响，结果见图6。由图6可知：经LH-EP固定化后的脂肪酶，其最适pH从7.0偏移至8.0左右。究其原因可能是由于酶分子所带电荷在固定化后发生了改变。通常情况下，带负电荷的载体往往导致固定化酶的最适pH向碱性偏移，而带正电荷的载体则将使固定化酶的最适pH比游离酶低。

图6 重组脂肪酶的最适pHFig.6 Optimal pH of recombinant lipase

脂肪酶经LH-EP固定化后温度和pH稳定性也发生改变，结果见图7和图8。由图7可知：当温度在35 ℃以下时，游离酶和固定化酶的稳定性没有太大差别，当温度升至40 ℃以上时，游离酶迅速失活，45 ℃时酶活只剩下35%左右，而固定化酶的热稳定性有所提高，在45 ℃放置6 h以后，残余酶活还有60%以上。同时，游离酶和固定化酶都不能耐受60 ℃以上的高温。

图7 重组脂肪酶的热稳定性Fig.7 Thermal stability of recombinant lipase

图8为固定化后对脂肪酶的pH稳定性。由图8可知：固定化后脂肪酶的稳定性有一定程度的增加，在pH4.0的缓冲液中存放12 h后，固定化酶的残余酶活为40%左右，而游离酶只剩25%左右；在pH大于8.0的缓冲液中存放12 h后，游离酶迅速失活，而在pH 10.0的缓冲液中固定化酶残余酶活仍然保持在35%左右。

图8 重组脂肪酶的pH稳定性Fig.8 pH stability of recombinant lipase

2.6 固定化重组脂肪酶对地尔硫卓中间体的拆分

利用质粒pET32a上的Trx标签与S.marcescensH30脂肪酶进行融合表达，显著提高了脂肪酶的可溶表达比例。由于Trx标签过大，与脂肪酶融合后可能影响其催化效果，特别是其催化拆分的光学选择性。此外，固定化也会对酶的催化性能产生影响。为此，按照1.7的方法考察固定化重组S.marcescensH30脂肪酶对地尔硫卓中间体的拆分效果。结果显示，固定化脂肪酶能够特异性拆分(±)-MPGM，且优先催化R构型，催化拆分的光学选择性与原始游离脂肪酶一致，说明融合表达、固定化均没有改变该脂肪酶催化拆分的光学选择性。经过14 h的反应，转化率为48.5%，底物的e.e.值为99.2%，表明本文制备的固定化重组脂肪酶对(±)-MPGM具有很好的拆分效果，具备工业化应用的潜力。

3 结 论

成功克隆了S.marcescensH30的脂肪酶基因，

通过对表达载体和诱导条件的优化，实现了可溶表达，在摇瓶中重组脂肪酶比酶活达到25 000 U/L。并通过镍柱进行纯化，环氧载体固定化，固定化脂肪酶最适温度为35 ℃，最适pH 8.0，在低于45 ℃，pH为5.0～8.0条件下比较稳定。该固定化脂肪酶能有效拆分(±)-MPGM，为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。

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(责任编辑 荀志金)

Recombinant soluble expression,immobilization and characterizationof lipase from Serratia marcescens H30

XU Jingjing1,SU Erzheng2,WU Xiangping1,MA Yushu1,WEI Dongzhi1

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,New World Institute of Biotechnology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Enzyme & Fermentation Engineering Laboratory,College of Light Industry Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

To enhance the recombinant soluble expression of lipase fromSerratiamarcescensH30 inE.coli,different expression vectors such as pGEX-4T-1,pET28a and pET32a were studied.After optimization of inducing conditions,the maximum lipase activity reached to 25 000 U/L in shake flasks.The recombinant lipase was purified by Ni-NTA superflow column.Two carriers were used to immobilize the recombinant lipase,and LH-EP was the best one.Optimal temperature and pH of the immobilized lipase were 35 ℃ and 8.0,respectively.The thermal and pH stability of the lipase was improved after being immobilized onto LH-EP.The kinetic resolution of (±)-MPGM by immobilized lipase was studied,and a conversion of 48.5% was achieved along with ane.e. value of 98.2%.Our study reveals the good potential of immobilizedSerratiamarcescensH30 lipase for application in industrial production of diltiazem.

Serratiamarcescens;lipase;soluble expression;immobilization;characterization;resolution

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.007

2013-08-27

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB721103、2012CB721003); 国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA022206B、2012AA020403)；国家自然科学基金(31201296/C200101)；中央高校基本科研业务费专项资金；生物反应器工程国家重点实验室开放课题

徐晶晶(1987—)，女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：酶工程；苏二正(联系人)，副教授，E-mail:ezhsu@njfu.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2014)06-0033-06