老年慢性阻塞性肺疾病稳定期患者下呼吸道细菌定植与细胞免疫功能缺陷的关系研究

陈 谨，何耀红，呼 玮，朱瑞霞，刘淑梅，张 萍，崔建英

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种可以预防和治疗的常见疾病，其特征是持续存在的气流受限，气流受限呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎性反应有关[1]。国外部分研究表明老年COPD患者在稳定期存在免疫功能低下，容易引起下呼吸道细菌定植(low airway bacterial colonization，LABC)，是促进气道炎性反应并导致肺功能进行性下降的重要原因[2]。本研究拟通过对老年COPD稳定期患者的下呼吸道标本做细菌培养并定量分析，测定痰及血中白介素8(IL-8)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)和痰免疫因子(CD4+、CD8+和CD4+/CD8+)水平来探索老年稳定期COPD患者LABC与细胞免疫功能缺陷的关系，从而指导疾病的临床治疗工作。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2011年1月—2012年12月在首都医科大学附属复兴医院呼吸科慢病管理人群中确诊的COPD患者220例，从中筛查出年龄≥65岁的患者106例，按研究标准选取60例患者，同时在体检中心招募同年龄段健康志愿者30例。入选标准：(1)老年COPD患者，年龄≥65岁；(2)COPD诊断明确，符合中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病诊断指南[3]，即吸入支气管扩张剂后1 s用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，可逆实验阴性，COPD的严重程度分级按照肺功能分级；(3)COPD稳定期：即既往6周无急性加重症状或罹患普通感冒及其他呼吸道感染性疾病；近4周未使用口服或静脉抗生素；既往1年急性加重发作至少1次；试验前72～96 h内停用H1-受体拮抗剂、β-受体阻断剂(可能提高反应性)、含咖啡因及可可碱的物质(如咖啡)，72 h内停用肾上腺皮质激素类药物及抗生素，48 h内停用茶碱类，12 h内停用β-受体兴奋剂、抗胆碱能抑制剂，8 h内停用色苷酸钠等药物。排除标准：(1)既往有哮喘、支气管扩张、支气管肿瘤及其他明确肺部疾病的患者；(2)全身糖皮质激素治疗剂量>20 mg/d；(3)既往确诊患有免疫系统疾病；(4)罹患其他感染性疾病者。(5)健康志愿者需近两个月内未服用不明成分中药、酒精及免疫调节药物。本研究经首都医科大学附属复兴医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意，并签署知情同意书参加此项研究。

1.2 标本收集

1.2.1 痰液收集

1.2.1.1 痰标本收集及细菌定量 入选患者在医生指导下漱口，深咳痰入无菌痰盒，无痰者则行3%氯化钠溶液雾化10 min后导痰，留取深部痰，并测定诱导痰前后的肺功能。合格痰液(<2 h，镜检如多核白细胞>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，或两者比例<1∶2.5为合格痰液)立即送检。立即用无菌氯化钠溶液冲洗痰液3次，用英国OXOID公司生产的Sputolysin使痰液均质化后，再进行细菌定量培养。Sputolysin与痰液比例为1∶1，此1∶1悬液视为原液(定量计算时加以校正)。预先准备好4个无菌试管，每管含氯化钠溶液4.5 ml。吸取混匀悬液0.5 ml加于第Ⅰ稀释管内(10-1)，再从第Ⅰ稀释管内吸取混匀悬液0.5 ml加于第Ⅱ稀释管内(10-2)，依次稀释，使第Ⅰ～Ⅳ试管内痰液稀释液分别为10-1～10-4。每次取痰液量0.01 ml接种于VX/苯乙醇血平皿和中国蓝琼脂培养皿及巧克力培养皿中。细菌生长后，按常规做细菌菌种鉴定。本试验诱导痰是在监测肺功能的情况下进行的，安全、可靠。

1.2.1.2 痰液制备 将第1步留取的剩余的痰标本(≥8 ml)用微量称称重，加4倍重量的0.1%二硫苏糖醇(DTT)，用振荡器震荡旋转15 min，并予吸管反复涡状抽吸，直至痰液与DTT均匀混合为止。再将混悬液放入离心机以1 500 r/s离心10 min，上清液分装，其中4 ml-80 ℃保存，备用。

1.2.2 血及血清标本的收集 抽取患者血液5 ml，用离心机以1 500×g离心10 min，血清分装，-80 ℃保存，备用。

1.3 方法 (1)采用美国RayBiotech试剂盒，使用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定痰液及血液中IL-8因子的水平。(2)高敏C反应蛋白(hs-CRP)的测定采用乳胶凝集法分别测定COPD稳定期患者和对照组血清hs-CRP。(3)痰T细胞亚群的测定应用美国BD型流式细胞仪，以淋巴细胞群设门，以相应的同型对照IgG染色细胞为阴性对照，每份样品检测1 000个细胞，用SimulSET型软件分析结果。具体步骤如下：①试验前将所有试剂及标本放置室温溶解；②分别加入CD4+和CD8+抗体(Ab)和同型对照各20 μl，双色标记单抗试剂，混匀后室温避光30 min。③加红细胞溶血剂2 ml，室温避光10 min后1 000 r/min离心10 min，弃去上清。④加磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml，洗涤1次，弃上清，再1 000 r/min离心10 min，弃去上清。再次加PBS 2 ml，1 000 r/min离心10 min，弃上清。⑤加500 μl PBS重悬细胞，上机检测分析。

1.4 肺功能的测定 采用德国Jaceger公司Master PET设备测定各项指标。通气测定FEV1、FVC及FEV1/ FVC。肺功能分级方法：轻度:FEV1≥80%；中度：50%≤FEV1<80%；重度：30%≤FEV1<50%；极重度：FEV1<30%。

2 结果

2.1 一般资料 观察组因痰液不合格剔除6例，距测定时间4周内服用抗生素剔除4例，最终纳入观察组50例，对照组30例。两组患者吸烟量、住院≥1次人数、FEV1、FEV1/FVC相比差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 痰标本细菌培养结果 老年COPD稳定期患者痰培养阳性者共32例(64.0%)，其中4例合并有2种致病菌，故共检出致病菌36株。主要是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、副流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌及真菌，分别占27.8%、16.7%、13.9%、11.1%、8.3%、8.3%、5.6%、5.6%、2.7%，见表2。定量分析结果显示30例(60.0%)COPD稳定期患者痰菌落计数大于106cfu/ml，确定为细菌定植，存在的致病菌分别为大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和真菌。

对照组中无致病菌检出，只有1例检出草绿色链球菌，其为口腔正常菌群，考虑由痰液污染引起。

2.3 不同肺功能分级的患者LABC情况 入选的老年COPD稳定期患者肺功能损伤全部在中度以上，其中有4例存在两种致病菌，占11.1%。肺功能分级中度者20例，细菌定植阳性率为50.0%(10/20)；重度者23例，细菌定植阳性率为65.2%(15/23)；极重度者7例，其中细菌定植阳性5例。

表1 两组临床资料比较

注：△为χ2值，余检验统计量值为t值，-为Fisher确切概率法；FEV1=1 s用力呼气容积，FVC=用力肺活量

表2 老年COPD稳定期患者LABC情况

注：细菌定植数量均已进行对数处理；COPD=慢性阻塞性肺疾病，LABC=下呼吸道细菌定植

2.4 不同定植情况患者细胞炎性因子水平比较 定植组与无定植组相比痰IL-8、血IL-8及血hs-CRP差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

Table3 Comparison of inflammatory cytokine between LABC and without LABC groups

组别例数痰IL-8(ng/L)血IL-8(ng/L)血hs-CRP(mg/L)定植组3040873±286096349±42981215±813无定植组2024261±85523666±1191 650±397 t值270353213P值001000004

注：IL-8=白介素8，hs-CRP=高敏C反应蛋白

2.5 老年COPD稳定期患者LABC痰细胞免疫因子水平 与对照组相比，定植组CD4+下降(q=11.64)，CD8+升高(q=7.65)，CD4+/CD8+比值倒置(q=10.60)，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，无定植组CD4+/CD8+(q=4.90)差异有统计学意义(P<0.05)。与定植组相比，无定植组CD4+(q=8.82)、CD8+(q=4.22)、CD4+/CD8+(q=4.57)差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

Table4 Comparison of cell immune factor among control group,LABC group and without LABC group

组别例数CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+对照组303840±4922432±876189±090无定植组203637±8262896±745129±027定植组302506±5973644±930073±031F值451160318P值001002001

3 讨论

本研究结果证实，部分老年稳定期COPD患者存在LABC，这与国内外的研究结果相同[4-5]。正常人下呼吸道是无菌的，因为机体存在完善的防御系统，但对于吸烟且存在气道阻塞的COPD患者，由于肺部防御体系的损害导致下呼吸道病原体清除障碍[6]，使COPD患者在稳定期时下呼吸道仍携带有细菌，即存在细菌定植。本研究也证实COPD患者与对照组在细菌定植方面有较大的不同。

本研究结果显示下呼吸道致病菌的检出率为64.0%，检出率较高，同时细菌定植量也较大，痰标本菌落计数大于106cfu/ml的占60.0%。因为本研究对象为老年患者，因此细菌定植率略高于其他国内外研究结果[7-8]。致病菌以流感嗜血杆菌和肺炎链球菌为主，分别占27.8%和16.7%，其次可见卡他莫拉菌、副流感嗜血杆菌分别占13.9%、11.1%，这也与国内外的报道相似[4，9]。除上述常见致病菌外，还可见一些院内感染致病菌如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及真菌等。其中4例患者可检出1种以上的致病菌，占11.1%，而这些患者都有1次以上住院经历。本组患者肺功能以中、重度阻塞性通气功能为主，肺功能损伤越重的患者，细菌定植率越高。

COPD稳定期患者中，存在细菌定植的患者痰IL-8和血IL-8水平高于无定植的患者，hs-CRP水平亦高于无定植的患者。有研究表明，中重度COPD稳定期患者可因为下呼吸道细菌定植而导致菌落数量增加，从而促进炎性反应，使气道发生一系列病理变化，包括炎性因子的升高使COPD急性加重趋于频繁[10]，本研究中也可以得出相似的结论。IL-8是最重要的细胞因子，是迄今发现的最强的中性粒细胞趋化因子，是中性粒细胞活化的标志。大量的中性粒细胞长期聚集，分泌多种细胞因子作用于气道局部，可以加重并延长炎性反应，因此痰中的IL-8水平明显高于血中的IL-8水平。同时IL-8的趋化作用和诱导中性粒细胞脱颗粒作用有助于对病原微生物的杀伤效应，而细菌及其代谢产物又会使呼吸道上皮细胞产生细胞因子，并因正反馈作用使炎性效应放大，进而导致全身炎性反应。COPD患者系统炎性反应的发生机制目前尚不清楚，目前有两种观点，第一种观点认为COPD患者肺内的炎性反应及其代偿事件导致炎性反应的“溢出”[11]，因为COPD患者体循环中也存在有类似气道炎性反应改变的因素，故有学者认为是气道炎性反应的“外溢”引起了系统炎性反应[12]。而第二种观点认为，COPD的肺部表现只是全身系统性炎性反应所累及的一个脏器。总之，既可以是系统性炎性反应起源于肺部炎性反应的“溢出”，也可能是多器官疾病造成系统性炎性反应的肺部表现[13]，具体的原因尚需进一步研究。CRP是肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，是反映机体感染的敏感指标，尤其是hs-CRP。肺部感染引起局部组织炎性反应损伤，其炎性反应及组织损伤物质大量进入肺循环，产生免疫反应，刺激各种细胞因子，通过相应的细胞因子介导在肝脏合成全身的CRP物质，导致机体反应性的CRP升高。但当感染控制和组织修复后CRP可迅速恢复，与疾病变化同步[14]。同时引起hs-CRP升高的原因还有高血压、冠心病、代谢综合征等疾病[15]，本次研究对象为COPD稳定期患者，定植组与无定植组的患者hs-CRP水平有差异，气道炎性反应是否通过外周血hs-CRP反映出来还有待进一步探索。

COPD稳定期患者定植组患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与健康人相比有差异，CD4+减少，CD8+升高，CD4+/CD8+甚至出现倒置情况。机体维持正常的免疫功能状态依赖于各种免疫细胞，特别是各类T细胞亚群之间的相互协作和制约，产生适度的免疫应答。越来越多的证据表明，COPD进展恶化的原因除病原微生物的侵袭外，还与机体免疫功能缺陷有关。COPD患者的免疫功能低下和紊乱表现为CD4+降低，CD8+升高，CD4+/CD8+比值降低，甚至倒置，本研究的结果与其一致。Tsoumakidou等[16]研究表明，CD4+/CD8+比值是反映机体免疫紊乱敏感指标，其比值的降低是机体免疫下降的重要标志，下降程度与疾病严重程度和预后不良密切相关。提示老年COPD稳定期患者下呼吸道细菌存在定植时机体免疫功能降低，T淋巴细胞扩增减少，影响抗原提呈，同时机体免疫功能缺陷时，机体的防御机制破坏，也容易导致COPD稳定期患者的LABC[17-18]。

对痰液标本的检测是研究COPD的重要方法之一。在以往的试验方法中，多数学者通过患者自行咳痰；用不同水平的氯化钠溶液行痰诱导留取标本；用吸痰管吸取深部痰液及纤支镜肺泡灌洗等方法获取痰液。前两种方法虽简单，但患者配合度差，痰液合格率低；后两种方法对于患者来说，痛苦较大，对气道黏膜也有一定的损伤，不易进行。因此在本次研究中进行痰诱导，而且所有进行痰诱导的患者均在严密监测肺功能的情况下进行，未出现不良反应，并提高了痰标本的合格率，因此是安全、可行的。

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关于慢性阻塞性肺疾病与细菌定植关系的假说如下：(1)恶性循环假说: 吸烟者的黏膜纤毛清除能力受损和局部免疫抑制使得细菌病原体较易在下呼吸道定植，这些定植的病原体及其产物又可通过增多气道黏液分泌、破坏纤毛运动能力和损伤气道内皮等进一步引起气道黏膜纤毛清除能力的损伤，从而使得细菌病原体在下呼吸道的长期定植更加容易。这种细菌及其产物对黏膜上皮细胞的潜在损伤作用在大气道可有利于细菌的残留，在小气道则有助于形成细支气管炎逐渐引起支气管阻塞。(2)新致病菌株学说：慢性阻塞性肺疾病的急性加重期可以检出新致病菌株，而检出的这些新致病菌菌株被认为与急性加重的发生密切相关，表明慢性阻塞性肺疾病的急性加重是由新致病菌株的感染造成。(3)细菌定量假说：慢性阻塞性肺疾病急性加重或其他症状的出现可能与呼吸道内细菌浓度的阈值有关。一旦超过阈值，就会出现气道炎症反应，从而产生临床症状，且不同患者的阈值不同，这与患者的个体差异、病程、基础疾病、免疫状态等多方面的修正因素，以及细菌类型、寒冷和空气污染对阈值的影响有关。