丹参酮对肺纤维化大鼠的干预作用及其机制研究

田淑霞 陈珺明 韩永龙 肖铁钢

（上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海，200233）

丹参酮对肺纤维化大鼠的干预作用及其机制研究

田淑霞 陈珺明 韩永龙 肖铁钢

（上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海，200233）

目的：观察丹参酮对博莱霉素致大鼠肺纤维化的影响及其作用机制。方法：SD大鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、地塞米松阳性对照组、丹参酮组、丹参酮加地塞米松组。大鼠气管内注射博莱霉素复制肺纤维化模型后，各给药组腹腔注射相应药物，给药1次d。28 d后处死动物，取固定部位肺组织分别行HE、Masson染色及电镜进行病理组织学检查；RT-PCR法检测丹参酮对大鼠肺组织中uPA、PAI-1 mRNA表达的影响。结果：与模型组相比，丹参酮组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度明显减轻（P＜0.05，0.01）；uPA显著升高而PAI-1表达明显降低（P＜0.05，0.01）；在与地塞米松联合时以上作用更加明显。结论：丹参酮对博莱霉素所致大鼠肺纤维化具有一定的治疗作用且与地塞米松有协同作用，其机制可能与抑制炎性反应细胞的浸润活化、细胞外基质沉积及调控UPA及PAI-1之间平衡有关。

丹参酮；肺纤维化；UPA；PAI-1；博莱霉素

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF）是由多种病因引起的肺泡间质性炎性反应及进行性细胞外基质（Extra Cellular Matrix，ECM）增多沉积的动态病理过程，进而导致肺远端有效换气面积减少，多数患者最终死于气道损伤和低氧性呼吸衰竭［1-3］。尿激酶型纤溶酶原激活物（Urokinase-type Plasminogen Activator，uPA）及其抑制物（Urokinase-type Plasminogen Activator-1，PAI-1）是调节ECM降解平衡的重要体系。丹参是常见的活血化瘀中药，丹参酮IIA磺酸钠是丹参提取物之一丹参酮IIA的水溶性衍生物。近年来许多研究表明，丹参酮IIA具有抗纤维化作用［4-5］。本研究采用博来霉素复制大鼠肺纤维化模型，观察观察丹参酮IIA对肺纤维化大鼠肺组织尿激酶型纤溶酶系统表达及肺组织超微结构改变的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂 丹参酮IIA磺酸钠（第一生化药业有限公司，国药准字：H31022558）；博莱霉素A5，（日本化药株式会社，批号：640110）；醋酸泼尼松龙片，（上海信谊药厂有限公司，批号：120122）；逆转录及PCR试剂盒（美国Invitrogen公司）；SYBR Green Supermix（日本东洋公司）；兔抗大鼠UPA单克隆抗体试剂盒、羊抗大鼠PAI-1单克隆抗体试剂盒（Santa Cruz Biotechnology INC）。

1.2 动物 雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量（260±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号为SCXK（沪）2009-0005。

2 方法

2.1 肺纤维化大鼠模型制备、分组与给药 将实验大鼠3%戊巴比妥钠30 mgkg腹腔注射麻醉后，无菌操作下行颈部正中切口，分离气管。模型组与治疗组大鼠气管内注入0.2～0.3 mL含博莱霉素A5（5 mgkg）的生理盐水，对照组注入等体积生理盐水，缝合切口并消毒处理，将大鼠直立旋转3 min，使药液在肺中分布均匀。大鼠随机分为5组（每组10只），分别为空白对照组（A组）、模型组（B组）、丹参酮治疗组（C组）、泼尼松阳性对照组（D组）、泼尼松联合丹参酮治疗组（E组）。于成模后第2日，C组和D组大鼠每天分别按10 mgkg和0.4 mgkg体质量腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠或泼尼松，E组给药为C、D组相加。其余2组每日给予等体积蒸馏水腹腔注射，实验周期为28 d。

2.2 病理学观察 迅速取右肺下叶4%多聚甲醛固定48 h，制备石蜡切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，Masson三色染色，参照文献［6-7］将肺泡炎和肺纤维化程度分级：无肺泡炎和肺纤维化；轻度肺泡炎和肺纤维化，受累面积小于20%；中度肺泡炎或肺纤维化，受累面积20%～50%；重度肺泡炎或肺纤维化，受累面积＞50%。一起经25 gL戊二醛中固定，按电镜常规进行标本制备。半薄切片后做超薄切片，日本JEM-1230型投射电镜观察。

2.3 肺纤维化大鼠uPA及PAI-1基因表达 提取大鼠左下肺组织总RNA。用分光光度法测定其总RNA含量及纯度。用RT试剂盒对总mRNA进行逆转录，合成cDNA，进行实时PCR反应。反应体系共25μL：cDNA和上下游引物各0.5μL，SYBS green supermix 12.5μL，去离子水11μL。循环条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸45 s，60次循环，55℃10 min。实时收集荧光信号，数据采用仪器自带软件ABIPrism 7300 SDS Software分析，计算出UPA、PAI-1mRNA的相对表达量。引物由上海英骏生物科技有限公司合成，序列见表1。

表1 UPA、PAI-1和GAPDH引物序列

2.4 统计学处理 应用SPSS 18.0软件进行分析，各组计量资料以（±s）表示，用单因素方差分析，两两比较用LSD-t法，等级资料采用Kruskall-Wallis法或Mann-Whitney法检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学的影响 HE染色显示：A组肺组织结构清晰，毛细血管正常，肺泡腔完整，无炎性反应细胞浸润。B组较A组肺泡腔及肺间质内可见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，毛细血管明显增生，病变部位广泛，差异具有统计学意义（P＜0.05）。C、D、E组较B组肺泡间隔增宽，极个别肺组织中见到肺泡腔中有单核巨噬细胞浸润及出血，程度均较轻，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Masson染色显示：A组肺组织结构清晰，无明显纤维组织增生；B组较A组肺组织结构破坏，重度炎性细胞浸润，大面积大量胶原纤维沉积呈束状而造成肺泡壁明显增厚及肺泡形态改变，支气管、血管周边广泛大量胶原沉积，有明显的间质纤维化，纤维化评分明显较正常组增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与B组相比，C、D、E组可见肺泡壁的增厚，炎性细胞浸润减少，肺组织损害减轻，有少量胶原纤维沉积，纤维化评分降低，差异具有统计学意义；C组与E组和D组比较，炎性细胞浸润及纤维组织明显减少，纤维化评分降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见图1，表2）。

表2 肺组织炎性反应及纤维化评分

病理标本电镜学观察：A组：肺泡上皮结构完整，Ⅰ型上皮细胞胞质扁平，其基膜与毛细血管基膜贴敷紧密，呼吸膜连续、较厚，Ⅱ型细胞形态正常，表面具有绒毛，内含嗜锇性分泌颗粒，为板层状；细胞间连接比较紧密，间质中有少量纤维，排列松散而稀疏。B组：肺组织整体结构比较疏松，呼吸膜出现分层、扭曲甚至破坏；Ⅱ型细胞绒毛减少甚至消失，板层小体大部分缺失呈空泡状；部分Ⅰ型上皮细胞线粒体肿胀，嵴消失呈空泡。血管内皮细胞核变形，核膜皱折，腔内有大量红细胞、中性白细胞，部分胞质空泡变性。成纤维细胞增多，肺间质大量纤维不规则堆积，排列紧密而凌乱。C、D、E组呼吸膜偶见分层或扭曲，连续性良好；Ⅱ型细胞绒毛基本正常，板层小体有较多残留；肺间质存在少量纤维（见图2）。

图1 光镜下肺组织病理学改变

3.2 对肺纤维化大鼠uPA与PAI-1基因表达的影响

B组大鼠肺组织UPA及PAI-1较A组均明显增加，但以PAI-1增加更加明显，C、D、E组大鼠UPA较B组明显增加而PAI-1明显降低（P＜0.05，0.01）（见图3）。

图2 电镜下肺组织病理学改变

图3 丹参酮对肺纤维化大鼠肺组织中uPA、PAI-1mRNA表达的影响

4 讨论

博莱霉素是一种抗肿瘤药，其不良反应之一是引起肺纤维化。用博莱霉素复制肺纤维化动物模型，已成为国内外公认的肺纤维化造模方法［8-9］。可用于研究肺纤维化的发病机制及药物筛选。本研究采用博来霉素复制大鼠肺纤维化模型，对照组大鼠的肺组织结构正常，未见炎性反应及纤维化病灶，而模型组大鼠的肺组织则出现不同程度的肺泡炎性反应变化，肺泡间隔增厚，肺泡腔破坏变窄或消失，成纤维细胞增生，肺间质胶原沉积，与文献报道的肺纤维化病变一致［10-11］。经过丹参酮治疗后，博莱霉素诱导的肺纤维化模型大鼠肺泡炎及肺纤维化程度明显减轻，表明丹参酮能减轻肺纤维化过程中的炎性反应及纤维化程度。ECM过度沉积是各种器官纤维化的共同表现［12-13］，肺纤维化也不例外［14］。ECM的过度沉积既是ECM合成过多，更大程度上是由于降解的减少引起的［15］。uPA主要参与血管新生、基质重构、肿瘤浸润及转移等过程，尤其是ECM的降解，因而与肺纤维化关系密切［16］。一方面，uPAR与pro-uPA特异结合后通过自分泌或旁分泌机制使uPA活化，另一方面，它还与活化的uPA高效结合，将uPA浓集于细胞表面，同时纤溶酶原通过其赖氨酸结合位点与细胞表面的纤溶酶原受体结合，两个系统在细胞膜上相伴作用，形成一高效的纤溶活化系统，活化的uPA将催化纤溶酶原转变为纤溶酶，介导ECM蛋白的水解。同时激活的纤溶酶也可作用于pro-uPA，使之变成有活性的uPA，形成一种正反馈现象。PAI是丝氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员，包括PAI-1、PAI-2及PAI-3。其中，PAI-1是uPA的主要抑制物［17］。PAI与uPA结合后被uPA降解，释放出PAI的羧基端，新产生的C末端精氨酸的羧基与uPA活性中心的丝氨酸的羧基生成酯键，从而抑制精氨酸一丝氨酸蛋白酶。PAI-1对uPA的抑制作用及uPa自身对uPAR的降解，共同参与uPA活性的负向调节［18］。一旦有各种致病因子打破这种统一，则使两者失衡，从而导致肺纤维化的发生、发展［19］。

正如本实验显示，与空白组相比，模型组uPA和PAI-1的表达明显增强，且PAI-1的增加更加明显，从而增加了胶原纤维的积累并促进肺纤维化的发展。与模型组相比，丹参酮显著升高了肺组织中PAI-1的表达，降低PAI-1的表达，从而证明丹参酮通过提高PAI-1抑制PAI-1而产生抗纤维化的作用。与地塞米松组相比，丹参酮组未表现出明显差异，而丹参酮与地塞米松联合显示出明显优势。

总之，本实验结果表明，丹参酮抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化过程，提高机体的抗炎、抗损伤能力，其作用机制可能与通过调控UPA与PAI-1之间的平衡，减少细胞外基质蛋白沉积有关。并且这一作用在与地塞米松联合时显示协同效应。

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（2014-04-15收稿 责任编辑：王明）

Influence and Mechanism of Tanshinone on Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Rats

Tian Shuxia，Chen Junming，Han Yonglong，Xiao Tiegang
（Department of Pharmacy Service，Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200233，China）

Objective：To investigate the effect of Tanshinone on urokinase-type plasminogen activator（uPA）and urokinase-type plasminogen activator-1（PAI-1）in rats with pulmonary fibrosis and to explore the possible mechanism.Methods：Fifty Spague-Dawley rats were randomly divided into the control group，model group，Tanshinone group，dexamethasone groupand Tanshinone add dexamethasone group.The rats of model group and the treatment group were induced pulmonary fibrosis with bleomycin（5 mgkg）endotracheally，while the rats of other groups were given normal saline instead.After 28 days，rats with Tanshinone treatment by Intraperitoneal injection administration once a day were killed.The rat lung histopathology was examined with HE staining，mass on staining and electron microscope.The influences of Tanshinone on the expression of uPA and PAI-1mRNA in lung tissue of rats with Bleomycin-induced pulmonary fibrosis were assayed by RT-PCR.Results：Compared with the model group，thealveolitis and fibrosis extentwere attenuated after Tanshinone treatment（P＜0.05，0.01），and the expression levels of uPA was increased and PAI-1 mRNA was decreased（P＜0.05，0.01）significantly.Compared with the dexamethasone group，therapeutic effect was more obviously when Tanshinone combine with dexamethasone（P＜0.01）.Conclusion：Tanshinone has a good action against experimental pulmonary fibrosis and has the synergetic effect with dexamethasone.The mechanisms might be related to the inhibition of activation of inflammatory cell infiltration，collagen deposition and regulation of equilibrium between the uPA and PAI-1.

Tanshinone；Pulmonary fibrosis；uPA；PAI-1；Bleomycin

R285.5

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.023

上海市浦东新区中医学科人才培养项目资助项目（编号：PDZYXK-3-2013008）