新加良附方联合5-Fu对荷人胃癌裸鼠血清VEGF、bFGF水平的影响

侯 丽许 晶王 婧郭晓青宋延平

（1北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京，100700；2陕西中医学院，咸阳，712046；3陕西省中医药研究院药理室，西安，710003）

新加良附方联合5-Fu对荷人胃癌裸鼠血清VEGF、bFGF水平的影响

侯 丽1许 晶2王 婧1郭晓青1宋延平3

（1北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京，100700；2陕西中医学院，咸阳，712046；3陕西省中医药研究院药理室，西安，710003）

目的：观察新加良附方联合5-Fu对荷人胃癌移植瘤裸鼠血清血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）水平的影响。方法：建立移植性人胃癌细胞（SGC-7901）裸鼠移植瘤模型，并将模型动物随机分为空白组、5-Fu组及新加良附方高、中、低剂量组、联合给药组（新加良附中剂量+5-Fu组）6组。新加良附方高、中、低剂量组给药剂量分别为10 g·d-1·kg-1、5 g·d-1·kg-1、2.5 g·d-1·kg-1；5-Fu组给药剂量为17 mg·d-1·kg-1；空白组给予等量无菌生理盐水，新加良附方联合5-Fu组剂量为新加良附方中剂量（5 g·d-1·kg-1）联合应用5-Fu（17 mg·d-1·kg-1）。给药结束后，采用免疫学方法（ELISA）检测裸鼠血清中VEGF、bFGF的含量。结果：VEGF含量显示：联合给药组，5-Fu组，新加良附大、中、小剂量组裸鼠血清中含量较空白对照组均明显降低（P＜0.01），新加良附各剂量组对VEGF含量减低作用具有一定的剂量依赖性，联合用药组VEGF含量低于5-Fu组、新加良附中剂量组，但无统计学意义（P＞0.05）。bFGF含量显示：联合给药组，5-Fu组，新加良附大、中、小剂量组裸鼠血清中含量较空白对照组均明显降低（P＜0.01）。结论：新加良附方可以下调人胃癌裸鼠的血清中VEGF、bFGF表达水平，提示新加良附方具有一定抗胃癌新生血管生成作用。

新加良附方；新加良附方联合5-Fu；VEGF；bFGF

肿瘤血管生成是指肿瘤组织在已存在微血管床基础上，以毛细血管为主的新生血管系统芽生与发展过程，是肿瘤生长和转移的重要病理学基础。自70年代初Folkman等［1］首先提出肿瘤生长依赖于新生血管生成以来，肿瘤血管生成机理与肿瘤血管抑制剂研究日趋活跃。经过几十年的应用基础研究发现，肿瘤新生血管形成是肿瘤发生、进展和转移的重要生物学行为。新加良附方由《良方集腋》中的良附丸加味而来，由高良姜、香附和穿山龙三味药物组成，处方中单味药均有抗癌作用的文献报道［2-7］。在前期新加良附方抗肿瘤血管生成的体内研究中，我们发现，新加良附方可以下调抑制移植型小鼠肝癌H22实体瘤组织中VEGF表达和微血管密度（Microvessel Density，MVD），初步表明新加良附方可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤效应［8］；新加良附方大、中剂量组可以抑制移植型人胃癌MGC803实体瘤组织的MVD、下调VEGF蛋白表达，表明新加良附方能够抑制人胃癌新生血管形成［9］。为进一步探讨新加良附方抗肿瘤血管生成效应及其机制，我们进行本次体内实验，从分子水平观测其对荷人胃癌SGC-7901移植瘤裸鼠血清中血管生成相关因子表达的影响。

1 材料

1.1 动物及细胞系 BALBC无胸腺裸鼠，SPF级，4～5周龄，60只，雌雄各半，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（湘）2011-00023，合格证号：4300470001967，在第四军医大学动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人胃癌（SGC-7901）细胞系，购于第四军医大学实验动物中心。

1.2 主要药物 按照中药新药制备工艺制备，新加良附方（浸膏或干燥原粉）由陕西星华制药有限公司提供；阳性药：注射用5-氟尿嘧啶（5-Fu）由上海旭东海普药业有限公司生产，国药准字：H31020593，产品批号110608。

1.3 仪器与试剂 实验试剂：1640培养液购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶；VEGF、bFGF酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒。实验仪器：超净工作台SW-CJ-IF（美国BIOLOGICAL公司）；CO2恒温培养箱（美国SHELDON公司）；TDZ4AWS台式低速自动平衡离心机；低温冰箱（日本SANYO公司）；酶标仪（美国伯乐）。

2 方法

2.1 复苏与培养 液氮罐中取出含有SGC-7901细胞的冻存管，放入37℃水浴内，使其溶化吸取细胞悬液并加入培养液（10%胎牛血清的RPMI1640培养液），人胃癌细胞株SGC-7901置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃饱和温度，5%CO2条件下培养传代。待细胞长满单层，用0.25%胰酶消化，培养液吹打离心1 000 rmin，5 min，去上清液收集细胞，传代培养或接种。

2.2 接种 将收集的细胞用PBS稀释，镜下细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×107个细胞m L，每只裸鼠以0.2 mL接种于颈背部，待肿瘤长至1 000 mm3时移植。

2.3 分组 待已接种裸鼠肿瘤体积约在100～300 mm3之间时，据性别，肿瘤体积大小将造模成功的裸鼠分成六组，空白组、5-Fu阳性对照组、新加良附大剂量组、新加良附中剂量组、新加良附小剂量组、联合给药组（即新加良附中剂量+5-Fu组），10只组，称重标号。

2.4 给药剂量时间及方法 空白组：以生理盐水每天0.2 mL10 g灌胃；5-Fu组：按17 mg·d-1·kg-1体质量腹腔注射，2次周。新加良附方各剂量组：高剂量组以10 g·d-1·kg-1灌胃给药，相当于成人剂量的20倍；中剂量组以5 g·d-1·kg-1灌胃给药，相当于成人剂量的10倍；小剂量组以2.5 g·d-1·kg-1灌胃给药，相当于成人剂量的5倍。联合给药组：即新加良附中剂量组与5-Fu联合给药，新加良附中剂量与5-Fu剂量同上，连续给药10 d。

2.5 标本收集及检测方法 给药第10 d后，裸鼠眼球取血1 mL，离心后取血清冻存，采用酶联免疫吸附双抗夹心法（ELISA）检测VEGF、bFGF的表达水平，严格按照说明书由专人操作。

表1 各组VEGF、bFGF蛋白表达水平（pg·mL-1）

3 结果

VEGF含量显示：联合给药组，5-Fu组，新加良附大、中、小剂量组裸鼠血清中VEGF含量较空白对照组均明显降低（P＜0.01），且新加良附方各组对VEGF抑制作用具有一定的量效关系。联合用药组VEGF含量低于与新加良附中剂量组及5-Fu组，但无统计学意义（P＞0.05）。bFGF含量显示：联合给药组，5-Fu组，新加良附大、中、小剂量组裸鼠血清中bFGF含量较空白对照组均明显降低（P＜0.01），新加良附方各剂量组bFGF含量无明显量效关系，见表1。

4 结论

胃癌在世界范围内最常见的恶性肿瘤中排名第四，为第二大癌症死因［10-11］。根据世界卫生组织统计及2012年中国肿瘤登记年报数据显示，2009年胃癌位居我国恶性肿瘤发病率第二位，死亡率第三位，发病人数占全球胃癌发病总人数的一半左右，是胃癌大国，与日韩等国不同，我国胃癌发病率和病死率高、仅10%左右为早期胃癌、以进展期病例为主要诊治对象等特点。近年来新发胃癌患者呈现年轻化趋势，30岁以下年轻患者的比例由上世纪70年代的1.7%蹿升至当前的3.3%，严重影响了社会劳动力和社会生产，给家庭和社会带来了很大危害［12］。近年来，随着新药的开发和新方法的应用，晚期胃癌的治疗效果有一定程度的提高，但远不如人们期望的那样乐观。中医药在缓解临床症状、对化放疗减毒与增效、提高患者生活质量、预防肿瘤复发与转移等方面具有优势与特色。通过临床实践发现，在胃癌发生与进展过程中，常有胃脘部隐痛、畏寒怕冷、得温则舒、遇寒加重等前驱症状，结合胃部肿块、胀痛、食欲减退、嗳气或呕吐、疲乏、胀痛、形体消瘦、舌质青紫、脉象细涩等临床特征，与“寒主收引、主凝滞、主痛”等中医理论相符，其病机关键是“寒凝→气滞→血瘀”，故而确立了“温阳散寒，理气活血”为胃癌基本治疗原则［13-15］，拟定由高良姜、香附、穿山龙组成的新加良附方（高良姜：香附：穿山龙为1∶1∶2），方中高良姜性味辛、大热，归脾、胃经，具有温中暖胃、散寒止痛之功效，为君药，针对寒邪凝结脾胃治疗；香附性味辛、微苦、微甘、平，归肝、脾、三焦经，具有疏肝理气之功效，为臣药，协助君药理寒凝之气滞，疏肝行气以止痛。两药相配，一散寒凝，二行气滞。穿山龙性味甘、苦、温，归心、肺经，活血通络，化瘀行血为佐药，助君药化寒凝之血瘀，协臣药理寒凝之气滞。三药合用具有“温胃散寒，理气活血”之功效，用以治疗或辅助治疗中晚期胃癌，在前期体内外实验及临床应用中取得一定疗效［16-17］。

胃癌生长具有明确的血管依赖。表皮生长因子受体（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）、血管内皮生长因子受体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）和人表皮生长因子受体-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor2，HER-2）的过表达与胃癌患者较差的预后存在相关性［18］。临床试验证明曲妥珠单抗（抗HER-2抗体）联合化疗对HER-2阳性的晚期胃癌或食管癌患者临床疗效优于单纯化疗［19］。贝伐珠单抗（抗VEGFR抗体）、索拉非尼和西妥昔单抗（抗EGFR抗体）的安全性及疗效也得到了II期临床试验初步肯定。基于AVAGAST研究显示的PFS优势，提示应进一步开展抗新生血管生成研究。中药或有效成分抑制肿瘤血管生成研究包括单味中药及其提取物以及中药复方的研究，如人参与人参皂苷Rg3［20-21］、莪术与榄香烯［22］等多项研究。

课题组在前期研究发现新加良附大、中剂量组能够抑制移植型人胃癌MGC803实体瘤模型以CD31作为标记的MVD，因此认为调控胃癌新生血管可能是新加良附颗粒抑制胃癌生长的效应机制之一［9］。肿瘤血管生成受到促血管生成因子（如VEGF、bFGF）的正反馈调节。本研究通过检测裸鼠血清中VEGF和bFGF表达水平来评估新加良附方的抗血管生成效应及机制。其中，VEGF是血管内皮细胞生长增殖的主要因子，对肿瘤血管生成具有较强和特异的调节作用，通过与血管内皮细胞生长因子受体结合，引起一系列的信号转导，刺激血管（淋巴管）内皮细胞增殖和迁移，VEGF高表达促进了肿瘤微血管生成且与胃癌进展密切相关，并与神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）表达存在协同关系［23］。本研究显示新加良附方可以下调荷人胃癌移植瘤裸鼠血清中VEGF表达水平，且该作用具有一定的剂量依赖性；新加良附方和5-Fu联合用药对VEGF表达抑制作用优于单独用药，但尚无统计学意义。bFGF是成纤维细胞生长因子家族中的一员，对多种细胞具有促进增殖促分化的功能，是一种生物活性较强的促分裂素，定位于染色体4q。bFGF不仅能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等分化增殖，还可促进成纤维细胞产生胶原，调控基质合成和降解，在肿瘤浸润转移和血管生成方面发挥重要作用，与VEGF、PDGF等细胞因子相互协同组成血管新生的调节网络［24］。本项研究显示新加良附方可以下调荷人胃癌移植瘤裸鼠血清中bFGF表达水平，但无明显量效关系。综上所述，本研究选择VEGF、bFGF两项指标从从血管生成角度进行了研究探讨，发现新加良附方可以下调人胃癌裸鼠的血清中VEGF、bFGF表达水平，且对VEGF作用具有量效关系，提示其具有一定抗胃癌新生血管生成作用。但血管生成是一个复杂的网络系统，这两项指标还远远不够，仅依赖某一因子的变化评价疗效存在不确定性，应在下一步研究中综合考虑多个因子的变化，从动态平衡的角度予以评价。

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（2014-02-11收稿 责任编辑：徐颖）

The Effects of Modified Liang-Fu Formula Combined with 5-Fu on VEGF，bFGF Expression of Human Gastric Cancer Xenografts in Nude Mice

Hou Li1，Xu Jing2，Wang Jing1，Song Yanping3
（1 Department of Oncology and Hematology，Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Xianyang 712046，China；3 Pharmacology Department，Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Xi'an 710003，China）

Objective：To observe the effect of Modified Liang-fu Formula（MLFF）combined with 5-Fu on VEGF and bFGF expression in the serum of human gastric cancer xenografted nude mice.Methods：The animal model of SGC-7901 xenografted nude mice was established，and all the mice were randomly divided into 6 groups；namely model control group（the same amount of normal sterile saline），5-Fu group（17 mg·d-1·kg-1），MLFF high-dose group（10 g·d-1·kg-1），MLFF medium-dose group（5 g·d-1·kg-1），MLFF low-dose group（2.5 g·d-1·kg-1）and drug combination group（5 g·d-1·kg-1MLFF combined with 17 mg·d-1·kg-15-Fu）. After 10 days of continuous treatment，eyeball blood was withdrew，them ice were killed，and the expression of VEGF and bFGF in the serum were detected using ELISA method.Results：Compared to model control group，the expression levels of VEGF in nude mice serum were significantly reduced in 5-Fu group，MLFF high-dose group，MLFF medium-dose group，MLFF low-dose group and drug combination group，respectively（P＜0.01），while MLFF reduced VEGF expression in a dose-dependent manner.The combination group showed a lower level of VEGF compared to 5-Fu group and MLFF medium-dose group，but there was no significant difference（P＜0.05）.Meanwhile，compared to model control group，the expression level of bFGF in nude mice serum was significantly decreased in 5-Fu group，MLFF high-dose group，MLFF medium-dose group，MLFF low-dose group and drug combination group，respectively（P＜0.01）.Conclusion：MLFF can down-regulate the expression of VEGF，bFGF in the serum of human gastric cancer xenografted nude mice.It indicates thatMLFF has the potential to serve as anti-angiogenesis agent for gastric cancer.

Modified Liang-fu formula；Modified Liang-fu formula combined with 5-Fu；VEGF；bFGF

R287

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.020

北京中医药大学科学科研基地建设项目北京市重点实验室（中医内科学）——新加良附方抗胃癌效应机制研究（编号：2011-JDJS-02）

宋延平（1964.6—），男，大学本科学历，研究员，药理研究室主任，研究方向：中药抗肿瘤新药的研究，E-mail：sypdd2003＠163.com