芪归银方对抗生素体外抑制多重耐药铜绿假单胞菌作用的影响

孔令博刘清泉杨 琦高 洁付跃峰

（1北京中医药大学东直门医院，北京，100700；2首都医科大学附属北京中医医院，北京，100010；3中国人民解放军第306医院，北京，100101）

芪归银方对抗生素体外抑制多重耐药铜绿假单胞菌作用的影响

孔令博1刘清泉2杨 琦1高 洁3付跃峰1

（1北京中医药大学东直门医院，北京，100700；2首都医科大学附属北京中医医院，北京，100010；3中国人民解放军第306医院，北京，100101）

目的：探讨芪归银方含药血清联合抗生素对多重耐药铜绿假单胞菌的体外抑制作用。方法：运用二倍稀释法检测单用抗生素、空白血清、含药血清及血清联合抗生素的体外抑菌情况。结果：空白血清对多重耐药铜绿假单胞菌无体外抑菌作用，含药血清则具有明显的体外抑菌作用；抗生素联合含药血清较单纯抗生素和抗生素联合空白血清的抑菌情况有明显差异。结论：芪归银方含药血清能够降低抗生素的MIC值、MBC值，提高抑菌率，含药血清与抗生素具有体外协同抑菌作用。

芪归银方；含药血清；抗生素；多重耐药铜绿假单胞菌；体外抑菌

由于第三代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用，近年来多重耐药和泛耐药菌株的检出率不断增高，铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶类和碳青霉烯类抗生素的耐药性明显增加［1-2］。其在国内各大医院细菌分离率调查中均居于首要位置［3］。众所周知，抗生素的不合理使用是细菌耐药的根源，因此，目前无论是多粘菌素或多种抗生素联合应用，还是研发新型抗生素等都不能有效解决细菌耐药问题。而近年来的研究证实了中医药在细菌耐药方面极具良好的应用前景［4］。现代药理学研究表明中药抑菌成分较多，可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段，并对细菌的多个代谢环节发挥作用，故不易产生耐药性［5］。有鉴于此，本实验以芪归银方为对象，研究含药血清与抗生素的协同作用，具体如下。

1 材料

1.1 药物 芪归银方（黄芪60 g、当归15 g、金银花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g）提取物（1.0 g/mL），由北京中医药大学中药学院中药研究室提供；头孢他啶（深圳致君制药有限公司，产品批号E20100102）、头孢哌酮舒巴坦钠（辉瑞制药有限公司生产，产品批号1039098）、亚胺培南西司他丁钠（Merck＆Co.，Inc.USA，产品批号100231），均购自北京中医药大学东直门医院药剂科，分别用生理盐水配制成512μg/mL、512μg/mL（以头孢哌酮的量计算）和128μg/mL（以亚胺培南的量计算）的溶液。

1.2 动物 SD大鼠16只，清洁级，体重200～220 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK-（军）2007-004。正常光照条件下，食、水可自由摄取，室温控制在18～22℃之间。

1.3 菌株 多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号，由首都医科大学附属北京朝阳医院细菌室提供。

1.4 试剂与设备 M-H琼脂平板购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司（批号：XWO1100301），立式自动电热压力蒸汽灭菌器（ASTELL公司，型号：AMA440N），恒温培养箱（SAMYO公司，型号：SIMF124），涡混合器（Scientific Industries公司，型号：VORTEX-GENIE 2），低温高速离心机（上海爱丁堡生物科技发展有限公司，型号：Kendro Labofuge 400R），微量天平（METTLER公司，型号：AE100），酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602）。

2 方法

1）将SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、芪归银方组，每组各8只，空白组予蒸馏水，芪归银方组给予芪归银方提取物灌胃，均为每日两次，每次2 m L，共5d，末次给药后1 h，将各组大鼠予10%水合氯醛溶液，按0.4 mL/100 g，腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血，4℃离心，2500r/min，20 min，无菌分离血清，将各组8只大鼠血清混合后，56～60℃水浴30 min，进行灭活。

2）在24孔板中分别依次加入0.8 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL、0.1 mL的空白血清和含药血清，然后用M-H肉汤培养基将各孔补至1 mL，再将含液体培养基的菌液（5×107CFU/mL）取10μL加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分别转种至含有M-H琼脂培养基的培养皿上，37℃，孵育18～24 h。

3）在24孔板中加入M-H肉汤培养基1 m L，再分别于每组的第一个空加入头孢他啶溶液、头孢哌酮舒巴坦钠溶液、亚胺培南西司他丁钠溶液，采用二倍稀释法将各孔依次对倍稀释，最终每个反应体系均为1 mL，再将含液体培养基的菌液（5×107CFU/mL）取10 μL加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分别转种至含有M-H琼脂培养基的培养皿上，37℃，孵育18～24 h。

4）在24孔板中加入M-H肉汤培养基0.5 m L，再分别于每组的第一个孔加入头孢他啶溶液、头孢哌酮舒巴坦钠溶液、亚胺培南西司他丁钠溶液0.5 mL，采用二倍稀释法将各孔依次对倍稀释，每个反应体系均为0.5 mL，再向每个孔加入M-H肉汤培养基0.3 mL和灭活后的两种血清0.2 mL，最终每个反应体系均为1 mL，其中血清的含量均为20%，然后将含液体培养基的菌液（5×107CFU/mL）取10μl加入各孔中，37℃，孵育18～24 h。然后分别转种至培养皿，37℃，孵育18～24 h。

3 结果

1）空白血清和给予大鼠等效剂量芪归银方提取物灌胃后得到的含药血清在反应体系中占80%时，仍无体外抑菌作用。见表1。

表1 空白血清和含药血清对多重耐药铜绿假单胞菌的抑菌作用

2）单纯头孢他啶MIC值为64μg/mL，联合空白血清后MIC值仍为64μg/m L，联合含药血清后其MIC值降为32μg/mL；单纯头孢哌酮舒巴坦钠MIC值为64μg/m L、MBC值为256μg/mL，联合空白血清后其MIC值无变化，联合含药血清后其MIC值和MBC值均有明显下降；单纯亚胺培南西司他丁钠MIC值为32 μg/mL，联合空白血清后其MIC值和MBC值变化不明显，联合含药血清后其MIC值降至8μg/m L，MBC值为16μg/mL。见表2。

表2 单纯抗生素与抗生素联合血清对多重耐药铜绿假单胞菌的MIC、MBC值

表3 相同抗生素浓度下单纯抗生素与抗生素联合血清对多重耐药铜绿假单胞菌的抑菌率

3）将24孔板中各反应体系用加样器取20μL加至96孔板中，每个反应体系3个副孔，经酶标仪检测各孔样本570 nm的OD值，求平均值，得出抑菌率。结果表明，在同一抗生素浓度下，抗生素联合含药血清组的抑菌率均明显高于单纯抗生素组和抗生素联合空白血清组。见表3、图1。

图1 相同抗生素浓度下单纯抗生素与抗生素联合血清对多重耐药铜绿假单胞菌的抑菌率趋势图

4）经东直门医院细菌室菌种鉴定，各组均为铜绿假单胞菌；药敏结果显示，含药血清组和亚胺培南西司他丁钠+含药血清组转种后的铜绿假单胞菌对头孢哌酮舒巴坦钠耐药性为中介，MIC值为32μg/mL，对其他抗生素耐药。其余各组转种后的铜绿假单胞菌对药敏试验所用抗生素均耐药，与实验菌株的药敏结果一致。

4 讨论

铜绿假单胞菌（PA）具有较强的快速适应能力，其产生多重耐药性的机制复杂，对某一类抗菌药物的耐药往往是几种机制协同作用的结果，对不同抗菌药物的耐药机制也不完全相同，而且还不断有新的耐药机制出现，目前已知的耐药机制主要有［6］：1）产生纯化酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶等；2）基因突变，如DNA拓扑异构酶及DNA回旋酶突变、主动外排泵系统的过量表达等；3）生物被膜；4）DNA错配修复系统。

基于中医药抗感染的历史经验和优势，近年来在中医药治疗耐药菌感染方面已有一些研究。夏金尧等［7］研究证实滇产五倍子、白芍等9种中草药对产超广谱β-内酰胺酶耐药大肠埃希菌具抑菌作用，对标准菌抗菌活性较大的提取物对耐药菌也具有较大的抗菌活性。肖洋等［8］研究结果表明五倍子提取液对铜绿假单胞菌R质粒具有较好的消除作用。席清平等［9］研究显示五倍子可抑制葡萄糖基转移酶活性，抑制葡聚糖生成，从而阻止生物膜形成。上述研究表明中药具有抑制耐药菌的作用，并能针对某些耐药机制逆转细菌耐药性，为中医药有效治疗耐药菌感染提供有力的依据，但是目前对中药与抗生素之间的联合作用研究较少。毋庸置疑，抗生素的杀菌、抑菌效果无可比拟，中药远远不及。从实验结果中也可以看出，提高头孢哌酮舒巴坦钠和亚胺培南西司他丁钠的浓度后二者还是能够起到对多重耐药铜绿假单胞菌1643号菌株的抑菌作用，但是，临床上不可能为了达到抗生素的抑菌作用而无限制地提高抗生素的剂量。因此，本实验以芪归银方和抗生素是否存在协同抑菌作用为研究对象，观察含药血清联合抗生素的体外协同抑菌作用，其结果显示头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦钠和亚胺培南西司他丁钠三种抗生素联合芪归银方含药血清与单用抗生素体外抑菌效果有明显的差异，含药血清能够有效降低上述三种抗生素的MIC、MBC值，提高抗生素的抑菌率，增强其抑菌、杀菌作用，为芪归银方联合抗生素有效治疗多重耐药菌感染提供了实验依据。提示芪归银方含药血清可能能够作为抗生素的“增敏剂”，降低耐药菌对抗生素的耐药程度，从而增强抗生素的疗效，减少抗生素的使用，缩短抗生素的使用时间。值得注意的是，药敏结果显示含药血清组和亚胺培南西司他丁钠+含药血清组转种后的铜绿假单胞菌对头孢哌酮舒巴坦钠耐药性为中介，MIC值为32μg/mL，提示芪归银方含药血清可能能够逆转耐药菌的耐药性，使其对原本耐药的抗生素重新恢复敏感。本课题组相关研究亦证实了这种可能性的存在，即芪归银方含药血清对β-内酰胺酶水解具有明显的抑制作用［10］，凸显了其解决细菌耐药这一棘手难题的潜力。同时，实验所用芪归银方，选用黄芪、当归补气养血以扶正，金银花、青蒿、虎杖清热解毒以透邪，组方切合耐药菌感染正虚邪伏的中医病机［11］，具有通过调节感染引起的炎症反应和免疫紊乱达到增强临床抗耐药菌感染疗效的潜力与优势，值得进一步研究。

［1］曹彬.多药耐药革兰阴性菌肺炎的抗感染治疗［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2008，7（1）：3-5.

［2］孙景勇，倪语星，汪复，等.2007年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2009，9（3）：192-195.

［3］许宏涛，宣天芝，陶凤荣，等.3种非发酵革兰阴性杆菌5年的分离率及耐药趋势回顾［J］.中国临床药理学杂志，2004，20（3）：219-221.

［4］蒋培余.中药抑制剂逆转细菌耐药性的研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10（10）：53-55.

［5］刘莎，符州.黄芪的免疫调节作用及其临床应用［J］.国际中医中药杂志，2006，28（4）：203-206.

［6］胡琴，陆学东，陈群.铜绿假单胞菌耐药机制研究进展［J］.中华医院感染学杂志，2009，19（3）：358-360.

［7］夏金尧，左国营，王根春，等.滇产中草药体外抗产超广谱β-内酰胺酶耐药大肠埃希菌的筛选研究［J］.西南国防医药，2009，19（7）：664 -666.

［8］肖洋，黄红兰，华芳.五倍子对铜绿假单胞菌R质粒消除作用的实验研究［J］.微生物学杂志，2003，23（2）：55-56.

［9］席清平，唐荣银，王秦芳，等.五倍子在人工口腔中抗菌斑生物膜作用的研究［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2004，14（3）：148-150.

［10］高洁，刘清泉，田金洲，等.芪归银方对耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药作用的影响［J］.中医杂志，2012，（16）：1408-1411.

［11］高洁，刘清泉，马群，等.从伏邪理论看耐药菌感染［J］.中医杂志，2011，52（6）：536-538.

（2014-02-17收稿 责任编辑：洪志强）

Study on the Effect of Qiguiyin Decoction and Antibiotics Inhibiting Multi-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa in Vitro

Kong Lingbo1，Liu Qingquan2，Yang Qi1，Gao Jie3，Fu Yuefeng1
（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Beijing Chinese Medicine Hospital，Capital Medical University，Beijing 100010，China；3 306 Hospital of People's Liberation Army，Beijing 100101，China）

Objective：To explore the bacteriostasis effect of Qiguiyin decoction combined with antibiotics inhibiting multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa in vitro.Methods：The antibacterial situation of antibiotics，blank serum，Qiguiyin decoction-containing serum and Qiguiyin decoction＆antibiotics-containing serum in vitro were detected with double dilution method.Results：Blank serum had no effect of bacteriostasis on multi-drug resistant PA，while Qiguiyin decoction-containing serum had significant effect of bacteriostasis on it，and there was significant difference between them.Besides，the serum with both Qiguiyin decoction and antibiotics showed more significant bacteriostasis effect.Conclusion：Qiguiyin decoction-containing serum could reduce the content of MIC，MBC in antibiotics and increase the bacteriostasis rate.Qiguiyin Decoction-containing serum and antibiotics have significant cooperation effect of bacteriostasis on PA in vitro.

Qiguiyin decoction；Qiguiyin decoction-containing serum；Antibiotics；Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa；Bacteriostasis in vitro

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.007

国家“十一五”科技重大专项（编号：2009ZX09103-415）；国家“十二五”科技重大专项（编号：2013ZX09102026）；中医药行业科研专项（编号：200907001）

刘清泉，E-mail：liuqingquan2003＠126.com，电话：（010）52176766