增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸*酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定

2014-02-05丁宁李坤*常明

中国医学装备 2014年9期

丁宁李坤* 常明

丁宁①李坤①*常明①

目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞，分为空白细胞组(未转染组)、pLNCX-EGFP-C1转染组(对照组)、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组(实验组)，每组设3个复孔，转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示，转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达；用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系，为后续试验奠定了基础。

人核糖核酸酶抑制因子；增强型绿色荧光蛋白；鉴定

丁宁,女,(1977- ),硕士，实验师。大连大学医学院医学检验实验中心，从事肿瘤分子生物学及临床生化检测相关研究。

[First-author’s address]Department of Biochemistry, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China.

研究发现肿瘤的发生是多因素、多阶段及长时间积累造成的癌基因激活、抑癌基因缺失或失活的基因病。因而，目前对肿瘤的治疗趋向于靶向分子治疗和创新药物的探索等。其中深入了解靶基因的功能，寻找要害靶分子，对之实施打击或补充是研究的主要内容。人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor，hRI)是相对分子质量为50×103的酸性糖蛋白，广泛存在于细胞的可溶性部分。研究发现，多数实体肿瘤能分泌血管生成素(angiogenin，Ang)，刺激血管的形成来供应癌细胞生长、增殖和转移。而hRI则具有与Ang紧密结合并抑制其活性的功能[1]。另一方面研究数据显示，hRI与Ang结合后，可抑制实体瘤血管的形成，从而抑制肿瘤的生长转移[2]。因此，hRI能否成为有效的靶向治疗药物一直是本实验组致力研究的课题。

为深入揭示hRI作为靶向分子治疗的作用机制，本研究构建了针对人RI基因的pLNCX-EGFP-C1-hRI载体[3]。为进一步验证该载体的作用效果，本实验用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞，用RT-PCR和Western blot检测EGFP-hRI基因在PA317细胞的表达情况，为下一步实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

(1)反转录病毒pLNCX质粒购自美国CLONTECH公司；pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒由本实验室前期构建；PA317包装细胞购自中国科学院上海细胞库。

(2)DL2000 DNA Marker、凝胶产物回收试剂盒、质粒中量提取试剂盒、DEPC处理水购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青血清生物制品有限公司；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜购自美国BD Biosciences公司；RT-PCR kit、ECL化学发光显色试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶抑制因子抗体由本实验室制备；RIPA蛋白裂解液购自南京KEYGEN凯基生物。

1.2 细胞培养与转染

PA317细胞在含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/ ml)及链霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培养基置于5%的CO2、37 ℃和90%湿度条件下培养。取对数生长期细胞按0.5×105～2.0×105铺板于24孔板中，至细胞达到融合度约80%左右时用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。分空白细胞组(未转染组)、pLNCX-EGFP-C1转染组(对照组)、pLNCXEGFP-C1-hri转染组(实验组)，每组3复孔。转染后72 h用新霉素筛选两周，获得单克隆、增殖、收获细胞，并观察阳性重组质粒在PA317细胞中的表达。

1.3 RT-PCR法检测转染后PA317细胞中RI基因转录水平变化

采用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应，以总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR反应，引物序列见表1。

表1 RT-PCR实验引物序列

PCR反应条件为：94 ℃，2 min，1个循环。94℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30个循环次。72℃，4 min；1个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由Bio-Rad凝胶成像仪检测后用Image LAbTM软件进行分析。用目的蛋白条带灰度值与β-肌动蛋白条带灰度值的比值表示目的基因的相对表达水平。

1.4 Western blot法检测转染后PA317细胞中RI蛋白表达水平

用胰酶消化细胞，以转速为1000 r/min离心10 min，经PBS洗2次后用含1 mM PMSF的RIPA蛋白裂解液提取蛋白，然后BCA法蛋白定量。各泳道取60 μg蛋白上样进行电泳、转膜，5%小牛血清封闭2 h，一抗孵育，4 ℃过夜；第2 d用TBST洗涤3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗涤4次后用ECL化学发光试剂盒发光。曝光时间30 s，由Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Image LAbTM软件进行分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件分析，实验数据以均数±标准差表示，样本显著性分析用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测hRI基因在转录水平上的表达

RT-PCR半定量分析显示，空白组(未转染组)及对照组细胞的RI基因和内参β-肌动蛋白基因产物条带分别是527和300 bp，且对照组比空白组hRI基因相对表达强度增加。pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组细胞EGFP-hRI融合基因和内参β-肌动蛋白基因产物条带分别是583和300 bp，其EGFP-hRI基因相对表达强度比空白组及对照组增强(如图1所示)。

图1 RT-PCR检测转染的EGFP-hRI基因在PA317细胞中的表达

2.2 Western blot检测hRI基因在蛋白质水平上的表达

Western blot检测hRI基因在蛋白质水平上的表达结果显示，空白组(未转染组)、对照组细胞可见hRI基因和内参β-肌动蛋白基因条带，且对照组比空白组hRI基因相对表达强度增加；pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组细胞可见EGFP-hRI基因和内参β-肌动蛋白基因条带，其EGFP-hRI基因相对表达强度比空白组及对照组增加。此结果与RT-PCR一致(如图2所示)。

图2 Western blot检测EGFP-hRI在PA317细胞中的表达

3 讨论

hRI位于胞浆内，是体内一种重要的调控蛋白，具有多方面调节作用[4]。其定位于染色体11 p15.5区，相对分子质量约50×103。在1级结构上，RI由460个氨基酸残基组成，87%的氨基酸组成7个重复单位，两个重复单位之间的平均同源性为39%[5]。每个重复单位中又包括α、β两种亮氨酸重复单位(leucine-rich repeats，LRRs)。目前国内外研究显示，LRRs结构域与膜和蛋白质、蛋白质和蛋白质等相互作用有关[6]。文献查阅表明，含有LRRs重复结构域的蛋白质显示了广泛的功能，包括细胞周期调节、DNA修复、细胞外基质的相互作用等[7-8]。人正常细胞内的RI主要具有以下功能：①抑制核糖核酸酶A(RNase A)的活性。在中性及碱性环境下与RNase A以1∶1化学计量比紧密结合，抑制其酶活性，从而保护mRNA和rRNA，促进蛋白质合成[9]；②抑制肿瘤血管的形成，RI能与Ang紧密结合(Ki=7.1×10-16mol/L)，从而抑制实体瘤血管的形成，抑制瘤体生长[10-11]；③RI具有抗机体氧化损伤的功能[12]。RI其活性中心结构中富含还原状态的巯基，能够减轻H2O2等引起的细胞过氧化损伤，抑制肿瘤生长及转移等[13-15]。

综上所述，RI可作为抗肿瘤治疗的重要靶向药物，可能为抑制肿瘤生长发挥重要作用。为进一步探讨其作用机制，本研究构建了针对hRI基因的表达载体pLNCX-EGFP-C1-hRI(绿色荧光蛋白融合hRI基因载体)并将其转染到PA317细胞中。RT-PCR和Western blot检测EGFP-hRI基因在转录后水平和蛋白质水平的表达情况：EGFP蛋白相对分子质量约为29×103，EGFP融合hRI蛋白相对分子质量约为79×103。证明EGFP-hRI基因被正确大量表达，从而说明成功建立了产生绿色荧光蛋白融合hRI的PA317包装细胞系，为后续试验奠定基础。

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Identification of the expression of recombinated plasmid pLNCX-EGFP-C1-hRI in PA317 packaging cell line/

DING Ning, LI Kun, CHANG Ming// China Medical Equipment, 2014,11(9):9-11.

Objective:To identify the expression of plasmid pLNCX-EGFP-C1-hRI targeting the gene of Human ribonuclease inhibitor (hRI) in PA317 cells which is capable of expression in mammalian cells.Methods:The vector of pLNCX-EGFP-C1-hRI was transfected into PA317 cells by Lipofectamine 2000 and then the expression of recombinated plasmid was verified in living cells by observing the transcription level of egfp-hRI fusion gene mRNA with RT-PCR method and the expression level of egfp-fusion hRI protein with western blotting method respectively.Results:Both RT-PCR and western blotting showed the egfp-hRI fusion gene was obviously expression in PA317 cells.Conclusion:The plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hRI targeting hRI is successfully constructed and the protein of hRI can be expressed in PA317 cells correctly.

Human ribonuclease inhibitor; Enhanced green fluorescent protein; Identification

1672-8270(2014)09-0009-03

R392.11

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.09.004