葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜芦醇含量及其环境因素的影响*

赵 光 李 珺* 陈超阳

葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜芦醇含量及其环境因素的影响*

赵 光①李 珺①*陈超阳①

目的：利用高效液相色谱法测定葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜芦醇的含量，并研究其含量的环境影响因素。方法：采用高效液相色谱法，使用ZORBAX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为30%乙腈水溶液；流速为1 ml/min；检测波长为306 nm；柱温为室温；分离测定葡萄酒中反式白藜芦醇的含量，并研究光照、温度及密封状况对其含量的影响。结果：张裕干红葡萄酒中反式白藜芦醇的含量为(1.01±0.03)mg/L，长城干红解百纳中反式白藜芦醇的含量为(2.36±0.02)mg/L。阳光照射、温度升高及密封状况差均会导致反式白藜芦醇含量下降。结论：不同品牌的葡萄酒中反式白藜芦醇含量相差较大，且应在低温、避光和密封的条件下贮存葡萄酒。

葡萄酒；高效液相色谱法；反式白藜芦醇

[First-author’s address]School of Chemical Biology and Phamaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China.

白藜芦醇(Resveratrol)又称芪三酚，化学名称为3，4’，5-三羟基-1，2-二苯乙烯(3-4’-5 -trihydroxystilbene)，是一种非黄酮类多酚化合物，为无色、无味针状结晶，难溶于水，易溶于有机溶剂[1]。天然的白藜芦醇有顺、反两种结构，自然界中白藜芦醇主要以反式构象存在，反式异构体的生物活性强于顺式。白藜芦醇可以与葡萄糖结合形成顺式和反式白藜芦醇糖苷，白藜芦醇糖苷在肠道中糖苷酶的作用下可以释放出白藜芦醇。

白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素，具有抗肿瘤、心血管保护、抗自由基、抗氧化及抗炎等广泛的生物活性[2]。白藜芦醇可以通过阻止调节性T细胞的抑制作用来进行抗氧化、抗炎，从而对抗高脂食物引起的肥胖症[3]。最近的研究表明，白藜芦醇可以通过调节肝脏的ATP含量，从而发挥其生物活性[4]。白藜芦醇抗肿瘤的作用得到了广泛关注，研究发现白藜芦醇对肺癌、肝癌、前列腺癌及乳腺癌等多种肿瘤具有显著抗瘤效应[5]。白藜芦醇抗肿瘤是一个多因素参与的复杂过程，可以通过抗氧化、抑制环氧化酶(COX)促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化等来发挥作用。近年来研究证实，白藜芦醇对细胞色素P450各亚型的活性也有不同程度影响[6]。白藜芦醇对血小板与黑色素瘤细胞黏附也有抑制作用，从而影响肿瘤细胞生物学恶性行为，抑制肿瘤细胞体外转移[7]。

白藜芦醇可以通过人工方法合成类似物，也可以从天然植物中提取，藜芦、决明、虎杖、葡萄、桑子、花生、凤梨、买麻藤以及朝鲜槐等70余种植物中含白藜芦醇及其甙类。其中葡萄中含的白藜芦醇较高，用于抵御真菌、紫外线等逆境胁[8-10]。人体适量地饮用葡萄产品，如葡萄酒、葡萄提取物等对身体健康有帮助，有益于人体的免疫机能[11-12]。

葡萄酒中的白藜芦醇含量受环境因素影响，植物的不同部位、不同产地和品种的葡萄酒样品中的白藜芦醇含量也会不同[13]。由于酿酒葡萄中存在白藜芦醇，因其在酿造过程中会引入葡萄酒中而备受关注。有关葡萄及葡萄酒中白藜芦醇的含量分析以及分析方法也有较多的研究，而对影响白藜芦醇在酿酒葡萄及葡萄酒中含量的因素研究较少[14]。

白藜芦醇提取方法主要有溶剂提取、酶法提取、超临界流体萃取、超声波辅助提取以及微波辅助提取等；白藜芦醇的检测有高效液相色谱法、气相色谱法、色谱—质谱法、毛细管电泳法、化学发光法、荧光法及电化学方法等[15]。高效液相色谱法作为经典的方法，用于葡萄酒中白藜芦醇含量检测更具有普适性，通过对相关的成分进行检测，并分析影响因素，进一步研究和作为质量评价标准，有良好的开发前景[16]。本研究建立葡萄酒中白藜芦醇含量的高效液相色谱检测方法，分析了不同产区酿制的葡萄酒中的白藜芦醇含量，并分析影响葡萄酒中白藜芦醇含量的一些因素。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂

(1)美国Agilent 1100高效液相色谱仪，ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Heidolph旋转蒸发仪，EYELA CCA-1111冷阱。

(2)甲醇(色谱纯，Fisher)，乙腈(色谱纯，Fisher)，乙酸乙酯为国药集团化学试剂有限公司出品，反式白藜芦醇标准品为南京泽郎公司出品，张裕干红葡萄酒(赤霞珠，标准号：GB15037)，长城星级干红葡萄酒(解百纳，标准号：GB15037-2006)。

1.2 样品制备

取葡萄酒400 ml，使用600 ml乙酸乙酯提取后用体积分数为3%的碳酸氢钠溶液洗涤，重蒸水洗涤至溶液为中性，无水硫酸钠脱水，溶液旋转蒸发去除溶剂，残留物用40 ml乙腈溶解后待用。

1.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为30%的乙腈和70%的水；流速为1 ml/ min；进样量为20 μl；柱温为室温；检测波长为306 nm。

1.4 阳光照射对白藜芦醇含量的影响

将葡萄酒供试品平均分为A、B两组，A组密封避光保存，B组密封于自然光源下保存。保持其他因素相同，葡萄酒样品于0 h、1 h和2 h后提取浓缩测定反式白藜芦醇含量。以A组样品为对照，研究光照对B组样品中反式白藜芦醇的含量是否有影响。

1.5 贮藏温度对白藜芦醇含量的影响

将葡萄酒平均分为A、B、C三个组，模拟日常的贮藏条件，将其分别避光密封贮藏于4 ℃(冰箱温度)、20 ℃(正常室温)、40 ℃(夏季较高室温)环境中。恒温6 h后分别测定各组中反式白藜芦醇的含量，研究贮藏温度对反式白藜芦醇的含量是否有影响。

1.6 密封状况对白藜芦醇含量的影响

将葡萄酒平均分为A、B两组，A组避光密封于阴凉处储存，B组避光开盖于阴凉处储存，保持其他条件相同，分别在24 h、48 h和72 h后测定其反式白藜芦醇的含量，研究密封状况对反式白藜芦醇的含量是否有影响。

2 结果与分析

2.1 定性分析

在选定的色谱条件下，测得反式白藜芦醇标准品的色谱图(如图1所示)，标准品保留时间为8 min。测得样品的色谱图如图2所示。

图1 反式白藜芦醇标准品HPLC色谱图

图2 葡萄酒样品HPLC色谱图

2.2 线性关系

精密称取反式白藜芦醇标样4.00 mg，用乙腈溶解并定容至50 ml，配成浓度水平为80.00 mg/L的标准溶液。将其逐级稀释成质量浓度分别为40.00 mg/ L、20.00 mg/L、10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.50 mg/L的标准溶液(因葡萄酒浓缩10倍后进行反式白藜芦醇含量测定，故配制的标准液质量浓度应相应增大10倍)[4-7]。每个浓度进样20 μl，在上述色谱条件下分析，以峰面积平均值对相对应的质量浓度建立回归方程。以相应峰面积Y对其进样浓度X(mg/L)进行线性回归，得线性方程为：Y＝167.36722X-213.24955(r＝0.999)。线性关系在2.50～80.00 mg/L时为良好。

2.3 精密度

取葡萄酒样品溶液重复进样并测定6次，计算其精密度相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.73%，表明反式白藜芦醇在样品中较为稳定。

2.4 回收率

精确量取反式白藜芦醇质量浓度已测定的葡萄酒浓缩液3份，每份1 ml，分别向其中加入反式白藜芦醇标准液(20.00 mg/L)1 ml、2 ml和3 ml作供试品溶液。摇匀进样，每组测3次。测定加样后溶液中反式白藜芦醇的质量浓度与加样前溶液中反式白藜芦醇的质量浓度，测得葡萄酒中反式白藜芦醇的加样回收率平均值为21.90 mg/L，RSD值为4.78%。

2.5 样品含量测定

取两种市售葡萄酒样品(张裕干红葡萄酒、长城干红解百纳)浓缩后分别进样20 μl，各平行重复测定3次，求其峰面积的平均值，并通过回归方程计算出反式白藜芦醇的质量浓度。测得张裕干红葡萄酒中反式白藜芦醇含量为1.01 mg/L，RSD值为0.03%；长城干红解百纳葡萄酒中反式白藜芦醇含量为2.36 mg/ L，RSD值为0.02%。

2.6 阳光照射对白藜芦醇含量的影响

将A、B两组长城干红解百纳供试品分别以避光、光照方式贮藏0 h、1 h和2 h后观察其含量的变化情况(见表1)。

表1 光照对反式白藜芦醇含量的影响(mg/L)

2.7 贮藏温度对白藜芦醇含量的影响

A、B、C三个不同温度组别于6 h后在长城干红解百纳葡萄酒中的反式白藜芦醇的含量见表2。

表2 贮藏温度对反式白藜芦醇含量的影响(mg/L)

2.8 密封状况对白藜芦醇含量的影响

A、B两组长城干红解百纳葡萄酒样品放置24 h、48 h和72 h后对应的含量见表3。

表3 密封状况对中反式白藜芦醇含量的影响(mg/L)

3 讨论

葡萄酒中白藜芦醇的含量低，难于检测。将葡萄酒提取浓缩10倍后进行测定，去除其他成分后反式白藜芦醇峰非常明显，故采用提取浓缩后进样的方式对反式白藜芦醇进行测定。测得张裕干红葡萄酒中反式白藜芦醇含量为1.01 mg/L(RSD值为0.03%)；长城干红解百纳葡萄酒中反式白藜芦醇含量为2.36 mg/ L(RSD值为0.02%)。实验表明，本研究所建立的葡萄酒中反式白藜芦醇含量测定方法准确可靠、重复性好、回收率高。而不同品牌的葡萄酒中反式白藜芦醇的含量有较大差异。长城干红解百纳葡萄酒中反式白藜芦醇的浓度较高。

在光照对葡萄酒中反式白藜芦醇含量的影响研究中，贮存1 h、2 h后，B组葡萄酒样品中反式白藜芦醇的含量均显著性低于A组。光照使葡萄酒中反式白藜芦醇含量下降可能是由反式白藜芦醇发生转化或降解所致。在温度对葡萄酒中反式白藜芦醇含量影响的研究中，将葡萄酒放置6 h后A、B、C三组葡萄汁样品中反式白藜芦醇的含量也呈递减趋势，推断其含量差异是由贮藏温度所导致，即反式白藜芦醇的含量随温度升高而下降。在密封状况对葡萄酒中反式白藜芦醇含量的影响研究中其结果表明，密封状况对反式白藜芦醇的含量有影响，密封条件差可导致反式白藜芦醇含量下降。因此，不同的外界环境因素会影响葡萄酒中反式白藜芦醇的含量，为减少反式白藜芦醇的损失，葡萄饮品应严格在避光、密封和低温环境中贮存。

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Research on anti-cancer active component in red wine

ZHAO Guang, LI Jun, CHEN Chao-yang// China Medical Equipment,2014,11(3):4-7.

Objective: To detect the anti-cancer component, trans-resveratrol in red wine by high performance liquid chromatography, and to determine the influence of environmental factors on its content.Methods: A method for determining trans-resveratrol in red wine by HPLC is described. The operating conditions were ZORBAX-C18column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) at room temperature, 30% acetonitrile as mobile phase at a flow of 1 ml/min and UV detection at 306 nm.Results: The content of trans-resveratrol in Changyu dry red wine and Great Wall Claret Cabernet are (1.01±0.03) mg/L and (2.36±0.02) mg/L, respectively. The results show that, sunlight, high temperature and poor seal condition can decrease the content of trans-resveratrol.Conclusion: The content of transresveratrol varies in different brands of red wine. Red wine should be stored in cool, dark and sealed conditions.

Red win; HPLC; Trans-resveratrol

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.03.002

1672-8270(2014)03-0004-04

R914

A

2013-11-18

国家自然科学基金(30500648)“以FAS为靶从元宝枫发展无耐药性的抗肿瘤药物”；北京市自然科学基金(7103168)“以介孔材料为载体从天然产物发展抗肿瘤靶向给药系统”；北京市教育委员会科技发展计划面上项目(KM201010025011)“从虎杖等天然产物中发展肿瘤化学预防药物”；首都中医药研究专项(ZM02)“医院制剂抗瘤丸治疗神经胶质瘤的作用机理研究”

①首都医科大学化学生物学与药学院 北京 100069

*通讯作者：lijun88@ccmu.edu.cn

赵光,女,(1961- ),硕士，副教授。首都医科大学化学生物学与药学院，从事医药化学教学与天然药物科研工作。