8种胞外酶在香菇不同生长阶段的活性变化

王伟科，陆 娜，周祖法，宋吉玲，袁卫东，闫 静

（浙江省杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024）

8种胞外酶在香菇不同生长阶段的活性变化

王伟科，陆 娜，周祖法，宋吉玲，袁卫东，闫 静

（浙江省杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024）

研究了香菇生长过程不同阶段胞外酶纤维素酶系 （羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶）、木质素酶系 （漆酶、愈创木酚酶、多酚氧化酶）、淀粉酶、半纤维素酶的活性变化。结果表明,香菇生长不同阶段均能检测到上述8种酶的活性,说明这些酶参与了香菇生长发育的全过程。各种酶活性峰值出现时间不尽相同,木质素酶的活性高峰出现在营养生长期,纤维素酶的活性高峰出现在生殖生长期,说明香菇生长过程中优先利用木质素。8种酶活性在香菇生殖生长阶段变化趋势较一致,从原基形成到子实体成熟均呈现逐步下降趋势。

胞外酶活性；香菇；不同生长阶段；变化规律

香菇属担子菌纲、伞菌目、侧耳科、香菇属［1］,其主要栽培基质是杂木屑。香菇生长过程中所需的营养主要通过菌丝向胞外分泌各种酶将木质纤维素及其他有机大分子物质降解后再吸收进细胞,并转化为蛋白及多糖等［2］获取。研究不同培养条件对香菇胞外酶活性影响的报道较为多见,但对香菇从菌丝生长到子实体成熟采收全过程中的酶活性变化研究报道甚为少见,为此测定并分析了8种胞外酶在香菇生长过程6个重要阶段的活性及变化过程,旨在深入了解香菇对栽培基质的降解利用规律和生长发育过程中的生理变化,为栽培基质配方的设置提供理论依据。现将有关结果报道如下。

l 材料与方法

1.1 菌种

香菇808引自缙云县山农农产品科技开发有限公司。

1.2 培养基配方

杂木屑78%,麸皮20%,石膏1%和糖1%。

1.3 粗酶液提取

每一生长阶段随机挑取3个菌棒,捣碎后混匀,准确称取培养料2份,每份5 g。1份样品加入25 m L去离子双蒸水,40℃浸提2 h,5 000 r· min-1,4℃离心10 min,取上清液,得粗酶液。另1份样品置于80℃下烘至恒重,称重。

1.4 葡萄糖和木糖标准曲线制作

［3］的方法制作葡萄糖和木糖的标准曲线。得到葡萄糖标准曲线回归方程Y= 0.812X-0.037,R2=0.958 6,木糖标准曲线回归方程Y=0.780 3X-0.027 6,R2=0.983 4。

1.5 胞外酶活性测定与定义

羧甲基纤维素酶。往试管中加入0.5%的羧甲基纤维素钠溶液 （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液配制）1.5 m L,再加入粗酶液0.5 m L,混匀,50℃恒温水浴保温30 m in,取出后立即加入DNS试剂1.5 m L,煮沸5 min,取出,冷却后加蒸馏水定容至20 m L,充分混匀。分光光度计540 nm波长处测光密度值 （D）,以煮沸灭活的酶液作对照,每组3次重复,取平均值。酶活力单位定义：1 g干培养物中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1个活力单位 （U）。

滤纸纤维素酶。往试管中加入粗酶液0.5 m L,再加入滤纸条50 mg（新华定量滤纸,约1 cm×6 cm）,50℃恒温水浴保温1 h,其后操作与羧甲基纤维素酶活性测定相同。酶活力单位定义：1 g干培养物中的酶量与底物作用60 m in释放出1 mg葡萄糖为1 U。

半纤维素酶。往试管中加入0.5% （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液配制）木聚糖溶液1.5 mL,加入粗酶液混匀,50℃水浴保温1 h,其后操作与羧甲基纤维素酶活性测定相同。酶活力单位定义：1 g干培养物中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg木糖为1 U。

淀粉酶。往试管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液（用pH值5.8,0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液配制）1.5 m L,加粗酶液0.5 m L,混匀,38℃恒温水浴保温30 min,其后操作与羧甲基纤维素酶活性测定相同,并于520 nm测 D值。酶活力单位定义：1 g干培养物中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1 U。

β-葡萄糖苷酶。取0.5 m L粗酶液,加入0.5 m L,10 mmol·L-1β-D-葡萄糖苷。将此反应混合液37℃反应2.5 h,待反应结束后,立即加入2.5 mL,1 mol·L-1Na2CO3终止液终止反应,冷却至室温后在400 nm波长处测D值。另外,取相同条件的反应液立即置于沸水浴中加热5 min灭活后加入2.5 m L,1 mol·L-1Na2CO3溶液,作为空白对照。酶活力单位：1U指使底物改变0.01吸光度所需要的酶量。

漆酶。往试管中加入3.36 mmol·L-1的邻联甲苯胺0.5 mL和pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸缓冲液3.4 mL,样品管中再加入粗酶液0.1 mL,对照管中加入煮沸灭活的粗酶液0.1 mL,混匀,28℃恒温水浴保温30 min,取出后立即于分光光度计600 nm波长测D值。酶活力以样品与底物反应30 min后的光密度的改变值表示。酶活力单位定义：1 g干培养物中的酶量每分钟使D600值改变0.01为1 U。

多酚氧化酶。在试管中加入2.0 m L, 0.1 mol·L-1的邻苯二酚,2.0 m L,0.05 mol·L-1的磷酸钾 （pH值6.0）缓冲液和0.1 m L粗酶液。反应液28℃保温30 m in后立即用紫外分光光度计400 nm处测D值。酶活力单位定义：1 g干培养物30 min内改变0.1个光密度值为1 U。

愈创木酚酶。取0.5 m L粗酶液,加入3 m L pH值4.6,0.1 mol·L-1乙酸盐缓冲液,0.5 m L 80 mmol·L-1愈创木酚,28℃恒温水浴反应30 min,取出在600 nm处测定D值。1 U为使底物改变0.01吸光度所需要的酶量。

2 结果与分析

2.1 羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶活性变化

从图1可知,从发菌到子实体成熟整个过程看,羧甲基纤维素酶的活性呈现为先降后升再降的变化过程。在发菌期,羧甲基纤维素酶活性较为稳定,基本维持在5 U左右；当菌棒进入转色阶段后,其活性稍有下降；而当原基至幼菇形成阶段,其活性又随之升高；从幼菇生长到子实体成熟阶段,其活性又呈现下降趋势。滤纸纤维素酶活性则在原基期至幼菇期达到峰值6.92 U,从幼菇到子实体成熟阶段又表现为逐渐下降。

2.2 β-葡萄糖苷酶活性变化

从图2可以看出,β-葡萄糖苷酶活性从菌丝发菌初期开始逐渐上升,到原基形成阶段达到高峰,峰值为88.33 U,随后随着原基的分化和幼菇生长,其活性又逐渐下降,到子实体成熟阶段,其活性也降至最低点。

图1 不同香菇生长发育阶段羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶活力的变化

图2 不同香菇生长发育阶段β-葡萄糖苷酶活力的变化

2.3 半纤维素酶活性变化

试验结果 （图3）表明,半纤维素酶活性变化表现为 “M”型走势,在菌丝营养生长阶段缓慢上升,在菌丝满袋到转色期这一阶段,其活性快速上升并达到高峰,峰值为5.24 U,原基形成阶段稍有下降,到幼菇生长阶段再次上升到5.13 U。从幼菇生长到子实体成熟阶段的变化又表现为下降。

图3 不同香菇生长发育阶段半纤维素酶活力的变化

2.4 淀粉酶活性变化

图4可知,淀粉酶活性在香菇整个生长发育阶段呈现典型的先升后降趋势。在营养生长阶段活性变化不大,基本维持在2 U水平；当菌棒进入转色阶段时,其活性迅速上升达到峰值5.14 U,随着原基分化、幼菇形成直至最后子实体成熟,淀粉酶活性逐渐下降,子实体成熟采摘期淀粉酶活性降至最低。

图4 不同香菇生长发育阶段淀粉酶活力的变化

2.5 漆酶、愈创木酚酶和多酚氧化酶活性变化

漆酶、愈创木酚酶和多酚氧化酶的活性可以衡量香菇菌丝对木质素的降解能力。结果 （图5-6）表明,3种酶的活性变化趋势表现十分相似。菌丝生长初期三者均表现为较高的活性,到菌丝满袋阶段活性均有所下降；当菌棒进入转色阶段后,三者的活性又呈现上升趋势；此后又一致呈现为下降趋势。三者在营养生长阶段活性均高于生殖生长阶段,说明对木质素的利用集中在菌丝生长阶段。

图5 不同香菇生长发育阶段漆酶、愈创木酶活力的变化

图6 不同香菇生长发育阶段多酚氧化酶活力的变化

3 小结与讨论

试验结果表明,从纤维素酶系中的羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和 β-葡萄糖苷酶 3种酶的变化趋势看,总体呈现出一定的相似性,均在原基和幼菇形成阶段达到峰值,说明在这一阶段培养基质中大量的纤维素被降解利用,从而为香菇原基的分化和幼菇正常生长提供充足的碳源。

在木质素降解过程中漆酶、多酚氧化酶、愈创木酚酶等酚氧化酶起着重要作用。香菇在菌丝生长阶段的前期,漆酶、多酚氧化酶、愈创木酚酶的活性较高,这与冯志勇等［4］的研究结果相一致。试验中发现,漆酶、愈创木酚酶和多酚氧化酶在香菇生长发育的过程中变化趋势十分相似,因此这3种酶对于分解木质素是否具有相互促进作用还有待于进一步研究。

试验中发现：香菇胞外酶的木质素降解酶活性高峰位于菌丝营养生长阶段；纤维素降解酶的活性高峰集中出现在生殖生长阶段；而非纤维木质素酶系的半纤维素酶和淀粉酶活性高峰却出现在转色期。由此可见,一是香菇胞外酶系之间的活性变化可能存在一定的互补性,这更有利于充分降解利用栽培基质中的各种营养成分,使得香菇生长发育过程中能获得持续不断的营养供给。另一方面也说明香菇生长发育过程中会优先降解栽培基质中的木质素,这与张晓昱［5］研究相一致。即当进入生殖生长阶段后,木质素酶系活性会迅速降低,纤维素酶系活性则快速上升,促进纤维素分解和利用,从而为原基形成、分化与生长提供能量。

在香菇整个生长发育过程中,菌棒转色是一个十分关键且特有的阶段。本次试验测定的8种胞外酶除了羧甲基纤维素酶活性在这一阶段稍有下降外,其余7种酶的活性在这一阶段均表现为上升趋势,而且其中有5种酶活性在这个阶段形成峰值,之后又迅速下降。而香菇转色成功与否与产量和质量均具有密切的关系［6-7］,因此这些酶与香菇产量、品质等是否具有相关性有待于进一步研究。

参考文献：

［1］ 顾新伟,何伯伟.浙南山区大型真菌 ［M］.杭州：浙江科学技术出版社,2012：19.

［2］ 任鹏飞,任海霞,曲玲,等.香菇胞外酶活性变化及其与农艺性状的相关性分析 ［J］.山东农业科学,2010（12）：11-14.

［3］ 王宪泽.生物化学实验技术原理和方法 ［M］.北京：中国农业出版社,2002：172-174.

［4］ 冯志勇,江昭月,潘迎捷,等.废菌糠及其辅料对香菇培养料中木质纤维素降解的影响 ［J］.食用菌学报,1996, 3（2）：9-16.

［5］ 张晓昱.香菇不同菌株胞外酶活性与生长发育的关系［J］.华中农业大学学报,1995,14（3）：259-262.

［6］ 吕作舟,食用菌栽培学 ［M］.北京：高等教育出版社, 2006：450-457.

［7］ 回晶,赵文静,邹志远,等.金耳液体培养过程中几种胞外酶活性的变化规律 ［J］.食用菌学报,2007,14（3）：29-32.

（责任编辑：吴益伟）

S 646

：A

：0528-9017（2014）04-0498-03

文献著录格式：王伟科,陆娜,周祖法,等.8种胞外酶在香菇不同生长阶段的活性变化 ［J］.浙江农业科学,2014（4）：498-501.

2014-02-11

杭州市科技发展计划社会发展科研专项 （20120433B11）

王伟科 （1981-）,男,浙江宁海人,农艺师,大学本科,主要从事食用菌育种和栽培技术研究工作。E-mail：akeok@126.com。

袁卫东,男,高级农艺师,主要从事食用菌研究与推广工作。E-mail：ywd0507@126.com。