Tween-60协同微波提取桑椹总黄酮的研究

韩 伟 徐剑宇 方若舟 黄伯骏

（华东理工大学中药现代化工程中心，上海200237）

0 引言

桑葚，又名桑葚子、桑实、黑葚、桑果，为桑科植物桑的果穗。我国的桑树种类以及桑葚产量均居世界首位，晒干或蒸后晒干即可作为中药材原料。桑椹中含有丰富的黄酮类化合物，如芦丁、花青素等，佟继铭等研究发现总黄酮有较好的抗心律失常[1]和降低血压[2]的作用，同时具有良好的抗衰老、抗溃疡、抗病毒等作用[3]，医用价值显著。但到目前为止，对桑椹总黄酮提取工艺的报道还较为少见。

桑椹总黄酮传统的提取方法为水提法，其提取率较低，高静等[4]研究得到桑葚的提取率仅为0.24%。随着中药现代化进程的推进，超临界提取、超声波提取、微波辅助萃取等新技术迅速涌现[5～7]。

微波辅助提取（MAE）和表面活性剂辅助提取是近年来兴起的新型提取技术，与传统的提取方法相比，其具有快速、高效、节能[8]的优点。目前，微波萃取已广泛应用于中草药有效成分的提取中[9]。本文以桑葚为体系，采用表面活性剂辅助微波法提取桑椹总黄酮，通过正交实验确定各因素的影响顺序，并得出最佳的提取工艺条件。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料、试剂与设备

药材：桑葚1 kg/袋，上海华宇药业有限公司生产。

试剂：芦丁标准品（＞95%），中国药品生物制品检定所生产；实验所用的其他试剂均为分析纯。

仪器与设备：UV1900PC紫外分光光度计，上海亚研电子仪器科技有限公司生产；SHB-Ⅲ型循环水真空泵，巩义市英峪予华仪器厂生产；JY5002电子天平，上海良平仪器仪表有限公司生产；SK3310HP超声清洗仪，上海科导超声仪器有限公司生产；ER-692微波提取装置，中国电子器件工业有限公司生产。

1.2 实验方法

实验的具体方法：（1）将干燥的桑葚粉碎备用；（2）准确称取桑葚粉3.00 g；（3）以一定比例加入去离子水；（4）加入一定量的表面活性剂；（5）微波处理供试液；（6）抽滤所得供试液；（7）显色后测定供试液吸光度；（8）计算黄酮得率。

1.3 总黄酮分析方法的建立

本实验利用黄酮类化合物在碱性条件下与A l3+形成稳定有色络合物，且在紫外—可见光分光光度计500～515 nm波长范围内有最大吸收的特性，采用中国药典所收载的亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠比色法[10]来测定黄酮的含量。

1.3.1 最大吸收波长的测定

1.3.1.1 溶液的配制

标准溶液：准确称取0.0212g芦丁标准品，溶于100m L的容量瓶中，得到0.212mg/m L的芦丁标准品溶液。

供试品溶液：即经微波辅助提取后抽滤所得的滤液。

1.3.1.2 最大吸收波长的确定

吸取芦丁标准溶液（0.212 mg/m L）及供试品溶液各2m L，分别置于25m L容量瓶中，加入5%亚硝酸钠试液1 m L，静置6 m in；加入10%硝酸铝试液1 m L，静置6 min；加入4%氢氧化钠试液10m L，并补加水至刻度，静置15m in。之后以相应试剂作为空白对照，于紫外—可见光分光光度计400～650 nm波长范围内进行扫描，结果如图1所示。将供试品溶液稀释到合适的倍数，作相同处理，于400～650 nm波长范围内扫描，结果如图2所示，确定最大吸收波长为500 nm。

图1 芦丁标准溶液的波长扫描结果

图2 桑葚样品溶液的波长扫描结果

1.3.2 芦丁标准曲线的建立[11]

分别吸取芦丁标准液（0.212 mg/m L）1 m L、2m L、3m L、4m L、5m L、6m L、7m L、8m L，各置于25m L量瓶中，按1.3.1.2所述的显色方法显色，以相应试剂作为空白对照组，使用紫外—可见光分光光度计在500 nm波长处测定吸光度。以测得的吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C（mg/m L）为横坐标，绘制标准曲线（图3），得标准曲线回归方程为：A=11.877C－0.009，线性浓度范围为0.008 6～0.068 5mg/m L，R2=0.999 7。可见A与浓度C之间呈良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。

图3 芦丁标准曲线图

利用标准曲线回归方程计算出供试品溶液中黄酮的浓度C（mg/m L），可根据下式计算总黄酮的得率：

式中C——样品中黄酮的浓度，mg/m L；

V——溶剂量，m L；

M——桑葚的质量，g；

n——溶液稀释倍数。

1.4 单因素实验

分别考察表面活性剂的种类和浓度、液固比、微波辐射时间等因素对桑葚总黄酮得率的影响。

1.5 正交实验

在单因素实验的基础上，选取对黄酮得率影响较大的因素进行正交实验设计，其因素水平表如表1所示。

表1 正交实验因素水平表L9（34）

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 表面活性剂的种类

图4 为不同表面活性剂辅助提取桑葚总黄酮的实验结果。由图可知，Tween-60对微波提取的辅助作用为最优。Tween-60属于水溶性表面活性剂，在水提过程中有良好的增溶作用，且其毒性较其他表面活性剂小，适于黄酮的提取，故选择Tween-60作为表面活性剂进行后续实验。

图4 不同表面活性剂辅助提取桑葚总黄酮的实验结果

2.1.2 表面活性剂浓度

图5 为表面活性剂浓度对桑葚总黄酮的提取结果的影响，由图可知，表面活性剂浓度在1.5 g/L时黄酮得率最高。当表面活性剂浓度较低时，增大表面活性剂用量可以显著增加药液体系中胶束的含量，从而大幅提升总黄酮的溶出率。但当胶束含量达到临界值时，继续增加表面活性剂用量不能形成有效的胶束，故其对于黄酮溶出率的影响变小甚至消失。而过多的表面活性剂会影响溶液整体的传质与传热，阻碍桑葚总黄酮的溶出。所以，此种情况下的表面活性剂浓度以1.5 g/L为宜。

2.1.3 液固比

液固比对桑葚总黄酮的提取结果影响如图6所示，可以看出，当液固比为40m L/g时，黄酮得率最高。这是因为在一定的范围内增加液固比，将使药材与溶剂之间的浓度差增大，传质推动力增加，有利于黄酮的溶出；但液固比过大，溶剂吸收的微波能量也会增加，从而减少了药材对能量的吸收，即溶液单位体积中药材所获得的微波能会相应减少，造成得率降低。故液固比取40m L/g为宜。

图5 表面活性剂浓度对桑葚总黄酮的提取结果影响

2.1.4 微波辐射时间

图7 为微波辐射时间对总黄酮提取结果的影响。由图可知，微波辐射时间在180 s时黄酮得率最高。这是因为在一定范围内增加微波时间，能使体系获得更多的能量，加速桑葚细胞壁的破裂，使总黄酮易于溶出。当微波时间超过180 s后，由于微波剂量过大，部分黄酮可能因为微波加热时间过长导致体系过热而产生分解，使得率降低。故提取时间以180 s为宜。

图6 液固比对桑葚总黄酮的提取结果影响

图7 微波辐射时间对总黄酮提取结果的影响

2.2 正交实验结果

在单因素实验的基础上，选取对黄酮得率影响较大的因素进行正交实验设计，结果如表2所示。由表2直观分析可知，当以黄酮得率为考察指标时，有A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，即各因素对桑葚总黄酮得率的影响程度依次为B＞A＞C，即液固比＞Tween-60浓度＞微波辐射时间；最优工艺条件为A2B2C2，即以水为溶剂，Tween-60作为表面活性剂，浓度为1.5 g/L，液固比取40m L/g，微波辐射时间180 s。经过重现性实验可知，该工艺条件下总黄酮的得率稳定在2.051%左右。

表2 正交实验结果

3 结语

本文以桑葚总黄酮的得率为指标，采用正交实验法优选表面活性剂辅助微波提取工艺参数。结果表明，对总黄酮得率影响最大的因素为液固比，其次为Tween-60浓度、微波辐射时间。最优工艺条件为：以水为溶剂，Tween-60作为表面活性剂，浓度为1.5 g/L，液固比为40m L/g，微波时间为180 s，在该操作条件下，桑葚总黄酮的得率为2.051%，且稳定性良好。

［1］佟继铭，符景春.黄芩茎叶总黄酮抗实验性心律失常作用观察［J］.承德医学院学报，1991（3）

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