UPLC法测定九味肝泰胶囊中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量

文 屏 王建文 蔡珊珊

1.深圳市药品检验所，深圳 518057；2.广东药学院，广州 510006

UPLC法测定九味肝泰胶囊中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量

文 屏1王建文1蔡珊珊2

1.深圳市药品检验所，深圳 518057；2.广东药学院，广州 510006

目的 建立九味肝泰胶囊中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量测定方法，弥补该品种质量标准的不完善之处。 方法 采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；流速为0.4 ml/min；检测波长为203 nm；柱温为35℃；进样体积为1 μl。 结果 人参皂苷Rg1及三七皂苷R1分别在0.10～1.50 mg/ml，0.04～0.60 mg/ml浓度范围内线性良好，平均回收率分别为99.4%、101.8%，RSD分别为0.5%、1.3%。 结论 该法方便、快速、准确，适用于九味肝泰胶囊中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量测定，可用于该制剂的质量控制。

超高效液相色谱法；人参皂苷Rg1；三七皂苷R1；含量测定；质量控制

三七（Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen）为五加科人参属植物，具有显著的活血化瘀、消肿止痛的功效，其主要活性成分为人参皂苷Rg1及三七皂苷R1，具有显著的抗炎活血作用[1-3]，被广泛应用于各种中成药中。2010年版《中华人民共和国药典》（简称“中国药典”）及其他相关文献均以人参皂苷Rg1和三七皂苷R1作为三七质量控制的指标成分[4-5]。为保证产品质量，有必要对中药成方制剂中人参皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量进行质量控制，建立准确、可靠的检验方法。九味肝泰胶囊收载于《中成药地方标准》上升国家标准内科肝胆分册[6]。由三七、郁金、蒺藜、姜黄、大黄、黄芩、蜈蚣、山药和五味子等9味中药组成，具有化瘀通络、疏肝健脾的作用，能治疗慢性乙型肝炎及HBV携带者，能尽快改善症状，恢复体征，改善肝脏微循环，阻断肝病慢性化发展，促进肝功能的恢复[7-8]。现行标准主要涉及3个鉴别项目，分别是三七药材、大黄（大黄素及大黄酚）、黄芩（黄芩苷）有关成分的鉴别以及大黄素含量测定项。目前，九味肝泰胶囊仅有关于大黄素、姜黄素以及黄芩苷等3个成分的HPLC含量测定的文献报道[9-11]，此外，还有采用TLC法对九味肝泰胶囊中的五味子醇甲进行含量测定的报道[12]。目前全国共有2个生产厂家，2个药品批准文号。生产厂家均按现行标准检验。目前该药品的质量标准中对于三七药材仅建立了鉴别项目，尚无含量测定质控项目。中国药典2010年版一部对三七药材中有效成分人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量测定方法采用HPLC，但检测时间比较长。为了提高本品的质量控制标准，建立更加快速、高效的控制三七药材投料情况的含量测定方法，本研究采用超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography，UPLC） 对该药品中的人参皂苷Rg1及三七皂苷R1定量分析方法进行了研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC超高液相色谱仪 （包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器及Empower数据处理系统，美国Waters公司生产）。METTLER-TOLEDO XS205电子分析天平 （十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

人参皂苷Rg1对照品 （中国食品药品检定研究所，批号为：110704-201223，含量以93.4%计算，供含量测定用）；三七皂苷R1对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110745-200617，供含量测定用）。九味肝泰胶囊 （湖南省新汇制药有限公司，批号：120701、120702）；三七阴性药材（按九味肝泰胶囊处方制备）；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITYBEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相：乙腈-水梯度洗脱（0～2 min：80%水；2～12 min：80%→81%水）；流速：0.4 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：35℃；进样量：1 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rg1对照品约0.01 g，精密称定，置于10 ml容量瓶中，取三七皂苷R1对照品约0.01 g，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。用2 ml移液管转移至20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得人参皂苷Rg1和三七皂苷R1混合对照品液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品约0.5 g，精密称定。精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀后滤过，精密取滤液10 ml，滤液蒸干，用15 ml水溶解，用乙醚萃取3次，每次30 ml，弃去乙醚层。用水饱和正丁醇萃取3次，每次30 ml，合并正丁醇液，正丁醇液用氨试液洗涤3次，每次30 ml，弃去碱水层，正丁醇液再用正丁醇饱和水洗涤3次，每次30 ml，分取正丁醇液，回收蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过（用 0.22 μm 滤膜），取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按制备过程取除三七外的其余药材，制成缺三七阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各1 μl进样，记录色谱图，结果显示，供试品色谱图中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的色谱峰能与其他成分很好地分离，分离度均＞1.5，理论塔板数按三七皂苷R1峰计算＞4000，阴性样品溶液在三七皂苷R1、人参皂苷Rg1色谱峰处均无干扰（图1）。

2.4 线性关系考察

图1 九味肝泰胶囊UPLC图A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.三七皂苷 R1；2.人参皂苷 Rg1

分别精密吸取混合对照品溶液 0.2、0.5、1、2、3 μl，注入超高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，得到两种成分的回归方程。其中，人参皂苷 Rg1回归方程 Y=7.12×105X+1.39×104，r=0.9999；三七皂苷 R1回归方程 Y=6.47×105X+5.48×103，r=0.9999。 表明人参皂苷 Rg1在 0.10～1.50 mg/ml，三七皂苷R1在0.04～0.60 mg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取人参皂苷Rg1、三七皂苷R1混合对照品溶液 1 μl，按“2.1”项下色谱条件操作，重复进样 6次。记录人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的峰面积，其RSD值分别为0.4%、0.3%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液（批号：120702）1 μl，分别于 0、4、8、10、24 h 进样测定，计算各成分含量的 RSD值。结果提示，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD值分别为1.0%、0.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：120702）6份，分别精密称定，按“2.2”项下方法制备和“2.1”项下色谱条件测定，计算人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量，结果提示，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD分别为1.7%和2.2%。

2.8 加样回收率试验

称取已知含量的九味肝泰胶囊 （批号：120702，含人参皂苷Rg1和三七皂苷R1分别为4.23、0.84 mg/g）6份，每份约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备和“2.1”项下色谱条件测定，并计算各组分回收率，结果提示，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的平均回收率分别为99.4%、101.8%，RSD分别为0.5%、1.3%（表1）。

表1 加样回收率实验结果

2.9 样品含量测定

分别取相同厂家共 2批样品（批号：120701、120702），按“2.2.2”项下方法制备和“2.1”项下色谱条件测定，以外标法进行定量，计算三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 提取溶剂和量的选择

九味肝泰胶囊属于复方中药制剂，处方含有九味中药，如直接用甲醇等试剂提取，供试品成分较多，干扰严重，必须建立一个合适的提取方法。本试验提取方法是基于皂苷提取通则的基础上，再加以补充而展开的。供试品制备方法即用甲醇溶剂加热回流后，滤液用乙醚等极性小的有机溶剂脱脂、然后用水饱和的正丁醇萃取，再用氨试液洗涤除杂[13]，弃除黄酮类苷元等杂质，对干扰成分如糖类等可采用加正丁醇饱和的水洗涤的方法除去。本研究在提取过程中进行了比较，没有进行乙醚脱脂这一过程时，杂峰干扰严重，后对提取方法进行改进，用乙醚萃取脱脂后，杂质峰干扰少，分离效果较好。

试验过程中发现样品用甲醇提取加热回流后，精密量取10 ml的滤液和全部滤液蒸干的提取效果不同，前者较后者杂质峰较少，分离效果较好。

3.2 提取方法的选择

本研究分别对索氏提取、大孔树脂D101和加热回流提取三种提取方式进行考察。参考相关文献[14-15]，大孔吸附树脂有较强的吸附色素等杂质的能力，可分离得到有效成分，能够达到去粗取精的目的，但对被测成分有损失且耗费时间长。索氏提取对于沸点较低溶剂如乙醚的提取率较高，但操作复杂。最终考察结果显示索氏提取、大孔树脂D101和加热回流提取效果几乎相同，故本试验最终采用简便且提取率高的加热回流方法提取。

[1]华声瑜，曲凤，陈丽平，等.人参皂苷Rg1对血小板聚集及环磷腺苷的影响[J].天津中医药大学学报，2012，31（1）：31-33.

[2]苏华，何飞，邱宏聪，等.三七皂苷R1在抗凝血酶参与下对体外凝血酶活性的影响[J].中国输血杂志，2013，26（2）：191-194.

[3]赵保胜，桂海水，徐暾海.人参皂苷Rg1抗炎作用实验研究[J].人参研究，2010，（4）：2-4.

[4]刘长青，何百寅，赖小平，等.HPLC测定经络贴巴布剂中 3 种皂苷的含量[J].广东药学院学报，2010，26（6）：590-594.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：1-12.

[6]国家中成药标准江编·中成药地方标准上升国家标准部分·内科肝胆分册[Z].2002：132.

[7]邓立记.九味肝泰胶囊与阿德福韦酯片联合治疗乙型肝炎后早期肝硬化的疗效分析[J].临床医学工程，2011，18（7）：1022-1023.

[8]季雪良，常峰，金凤，等.九味肝泰胶囊联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎临床研究[J].中西医结合肝病杂志，2013，23（4）：203-205.

[9]熊建文，张群，吴灿.高效液相色谱法测定九味肝泰胶囊中大黄素含量[J].中南药学，2003，1（4）：234-236.

[10]郑冰珊，陈晓城.高效液相色谱法测定九味肝泰胶囊中黄芩苷含量[J].浙江中医药大学学报，2008，32（5）：677-678.

[11]叶优苗，张建方，陈宗良.高效液相色谱法测定九味肝泰胶囊中姜黄素含量[J].中国药业，2003，22（11）：41-42.

[12]蔡步林，王艳，丁野，等.九味肝泰胶囊质量标准的研究[J].中国药师，2012，15（10）：1442-1444.

[13]李剑锋，晏亦林.反相高效液相色谱法测定健脾固表颗粒中人参皂苷 Rg1、Re 的含量[J].医药导报，2006，25（6）：573-574.

[14]龙彦纲，黄晓其，林荣锋，等.HPLC法同时测定三芎止痛膏中三七皂苷和人参皂苷的含量[J].中国新药与临床药理，2008，19（1）：56-58.

[15]黄晓其，曾宝，苏子仁.高效液相梯度法测定红花牡丹膏中人参皂苷 Rg1、Rb1、Re及三七皂苷 R1的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27（10）：1393-1396.

Determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule by UPLC

WEN Ping1WANG Jian-wen1CAI Shan-shan2
1.Shenzhen Institute for Drug Control in Guangdong Province,Shenzhen 518057,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China

ObjectiveTo establish an UPLC method for the content determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule.MethodsACQUITY BEH C18analytical column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used with the mobile phase consisting of acetonitrile-water in gradient elution at a flow rate of 0.4 ml/min.The detection wavelength was 203 nm,column temperature was 35℃,and injection volume was 1 μl.ResultsGinsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule had good linearity within the range of 0.1-1.5 mg/ml and 0.04-0.6 mg/ml respectively,and their recoveries were 99.4%,101.8%,with RSD of 0.5%,1.3%respectively.ConclusionThe method is convenient,quick,correct for determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule,and can be used for the quality control for Jiuweigantai capsule.

Ultra performance liquid chromatography;Ginsenoside Rg1;Notoginsenoside R1;Content determination;Quality control

R927.2

A

1674-4721（2014）04（a）-0009-04

文屏（1982-），女，硕士，主管药师，研究方向：中药有效成分及中药分析

2014-01-09 本文编辑：袁 成）