乳腺癌组织及血清MICA表达特点

张晓燕 周 斌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。2011年美国《Chemical Abstracts》杂志公布的最新统计数据显示，仅2011年美国就将有20万以上的女性罹患乳腺癌，其发生率已占据妇科肿瘤的31%［1］。近年来主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(MICA)越来越吸引研究者兴趣。肿瘤细胞表面表达NK细胞的活化型受体(NKG2D)的配体MICA蛋白，激活NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞。随着肿瘤进展，组织细胞的MICA从肿瘤细胞表面脱落到癌细胞周围的间质组织及血液中，成为可溶性MICA，下调NK细胞对抗肿瘤细胞的作用，可能是肿瘤免疫逃逸的机制［2，3］。本研究通过检测乳腺癌组织及血清中MICA表达水平，探讨其与乳腺癌进展相关临床参数的相关性，为临床诊断提供新的参考，为进一步以MICA为靶点进行乳腺癌免疫治疗提供基础。

材料与方法

1．实验对象:收集具有明确病理和影像学诊断的乳腺癌患者组织32例，按照1972年国际抗癌协会修订的乳腺癌临床分期法分期，其中Ⅰ期+Ⅱ期15例，Ⅲ期+Ⅳ期18例;同时收集血清56例，患者年龄25～69岁，平均年龄43．5岁;乳腺良性疾病组69例，包括乳腺纤维瘤，乳腺小叶增生等其他乳腺疾病患者，年龄23～67岁，平均年龄45．2岁;笔者医院女性健康体检者75例为正常对照组，年龄21～65岁，平均年龄 41．6 岁。

2．RT-PCR检测:MICA液氮研磨约1g组织标本，Trizol试剂提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录成cDNA后，进行MICA的PCR反应，引物序列为上游:5'-CTGTGCCATACCAGTTAA-3'，下 游:5'-ATCAAGGACCAGAAAGAAGG-3'，产物片段长439bp;PCR反应条件:94℃ 2min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，循环 35 次，72℃ 延伸5min，4℃保存;PCR产物上样于1．5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，凝胶成像系统分析，以MICA和β-actin电泳带的荧光强度灰度值的比值表示其mRNA的相对表达量。

3．血清MICA检测:收集各组患者及健康体检者血清标本，储藏于-70℃冰箱备用。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测各标本中MICA浓度。

4．统计学方法:运用SPSS 16．0统计学软件进行分析，计量资料应用均数±标准差(±s)来描述，阳性率的比较采用卡方检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．乳腺癌组织MICA PCR结果分析:乳腺癌及癌旁组织MICA PCR电泳结果如图1所示，乳腺癌病灶组织和相应的癌旁组织阳性表达率分别为81．25%(26/32)和9．38%(3/32)。

图1 PCR产物电泳结果图

2．乳腺癌组织MICA mRNA表达水平与临床病理特征相关性分析:以MICA和β-actin电泳带的荧光强度灰度值的比值表示其 mRNA的相对表达量，乳腺癌组MICA mRNA相对表达量为1．36±0．18，显著高于乳腺癌旁组织0．76±0．09;15例Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌组织MICA mRNA相对表达量表示成1．75±0．39，显著高于Ⅲ期 + Ⅳ期 0．96 ±0．13(P ＜0．01);其表达量与淋巴结转移无明显的相关性。

3．血清中MICA的ELISA结果:与56例乳腺癌患者MICA水平相比，乳腺良性病组和健康体检者其浓度明显降低，差异均具有统计学意义(P＜0．05)。乳腺良性病患者血清MICA较健康体检者高，无统计学差异(表1)。

表1 各组血清MICA ELISA检测结果

4．MICA浓度与乳腺癌临床病理特征相关性:33例Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中含量明显高于Ⅰ期+Ⅱ期，淋巴结转移者MICA浓度明显高于未转移者，MICA浓度与患者年龄和分化程度无明显相关性，具体情况见表2。

表2 MICA浓度与乳腺癌临床病理特征相关性

讨 论

近年来乳腺癌的发病率逐年上升，严重威胁健康，对乳腺癌的早期诊断是提高生存率和生活质量的关键。NK细胞在控制肿瘤发生、发展过程中起重要作用，通过识别肿瘤细胞表面活化和抑制性分子标志，从而控制对肿瘤细胞杀伤作用。NKG2D是NK细胞表面一个重要的激活性受体，能识别肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(MICA)，从而激活NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞［4］。研究表明早期分化程度较高的肿瘤组织细胞MICA表达量较高，迅速诱导NK细胞杀伤肿瘤细胞发挥免疫监视作用。本研究发现乳腺癌组织MICA mRNA表达水平明显高于癌旁组织，说明MICA来源于肿瘤组织，可能作为乳腺癌诊断新的潜在标志物。晚期肿瘤细胞表面MICA蛋白脱落释放到间质及血清中形成可溶性MICA进而引起肿瘤免疫逃逸［5，6］。血清中可溶性MICA可通过ELISA法进行检测，本实验中笔者检测出乳腺癌血清中其水平明显高于良性疾病和健康体检者，说明其来自肿瘤组织。随着肿瘤进一步进展，血清中浓度明显升高，肿瘤细胞表面的MICA脱落到血清中变成的可溶性sMICA进一步加剧，从而导致其失去介导NKG2D杀灭肿瘤细胞的作用，故可能作为肿瘤逃逸指标［7］。

本研究发现，Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌组织MICA mRNA表达显著高于Ⅲ期+Ⅳ期，而Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中MICA蛋白表达量显著高于Ⅰ期+Ⅱ期。乳腺癌患者初期肿瘤细胞表面表达MICA，组织中表达水平增高，随着肿瘤进展，肿瘤细胞表面MICA蛋白脱落释放到间质及血清中形成可溶性MICA进而引起肿瘤免疫逃逸，此时组织中MICA检测量降低，而血清中可溶性MICA量升高，血清可溶性MICA随着分期逐渐升高，削弱了NK细胞对肿瘤细胞免疫抑制作用，可以此为肿瘤免疫治疗研究靶点。同时血清中可溶性MICA还与淋巴结转移相关，可能作为乳腺癌转移与否的辅助判断指标。

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2 Zou Y，Stastny P．Role of MICA in the immune response to transplants［J］．Tissue Antigens，2010，76(3):171-176

3 Sanchez-Correa B，Morgado S，Gayoso I，et al．Human NK cells in acute myeloid leukaemia patients:analysis of NK cell-activating receptors and their ligands［J］．Cancer Immunol Immunother，2011，60(8):1195-1205

4 Ashiru O，López-Cobo S，Fernández-Messina L，et al．A GPI anchor explains the unique biological features of the common NKG2D-ligand allele MICA*008［J］．Biochem J，2013，454(2):295-302

5 Bedel R，Thiery-Vuillemin A，Grandclement C，et al．Novel role for STAT3 in transcriptional regulation of NK immune cell targeting receptor MICA on cancer cells［J］．Cancer Res，2011，71(5):1615-1626

6 Kloess S，Huenecke S，Piechulek D，et al．IL-2-activated haploidentical NK cells restore NKG2D-mediated NK-cell cytotoxicity in neuroblastoma patients by scavenging of plasma MICA［J］．Eur J Immunol，2010，40(11):3255-3267

7 Serrano AE，Menares-Castillo E，Garrido-Tapia M，et al．Interleukin 10 decreases MICA expression on melanoma cell surface［J］．Immunol Cell Biol，2011，89(3):447-457