2009～2011年大庆地区感染人轮状病毒G血清型鉴定

文 程 王 薇 何旭辉

轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，是引起人类急性腹泻的主要病原体之一，并具有极强的传染性。尤其A组RV是导致婴幼儿腹泻最常见的原因，全世界每年因轮状病毒感染导致腹泻的患儿大约有1．11亿，其中死亡人数约有50万左右［1］。VP7蛋白是位于RV外壳的主要结构蛋白之一，可诱导人体产生中和抗体。根据RVVP7蛋白的特异性不同，可将RV分为不同的G血清型，至今已发现14个 G 血清型(G1～G14)［2］。因此，对某一地区流行的RV进行G血清型鉴定，对了解当地RV流行病学特征以及RV感染性腹泻的预防与诊治有非常重要的指导意义。现对2009～2011年大庆市区各二级及以上医院采集的288例腹泻患者(其中儿童197例，成人91例)的腹泻标本进行RV阳性鉴定，将鉴定为RV阳性的标本利用分子生物学技术进行RVG血清型鉴定，以期通过了解大庆市RV的血清学特征，能为当地RV的流行病学调查、RV感染性腹泻的诊治以及RV疫苗的选用起到指导作用。

材料与方法

1．主要试剂:胶回收试剂盒，小量质粒提取试剂盒和RNA提取试剂盒、ExTaq DNA聚合酶、DNA marker DL 2000、DMSO、IPTG、pGEM-T Easy Vector，反转录酶AMV和dNTP购自大连宝生物公司;A组轮状病毒ELISA检测试剂盒购自OXOID公司。

2．轮状病毒的ELISA检测:将288例腹泻标本反复冻融3次后，用A组轮状病毒ELISA试剂盒的稀释液将腹泻标本稀释成10%的悬液，10000r/min离心5min，利用A组轮状病毒ELISA检测试剂盒进行RV阳性检测。

3．一步多重RT-PCR鉴定RV血清型:①取处理过的标本上清液200μl，按照Trizol Reagent试剂说明书提取轮状病毒dsRNA;②参照GenBank上发表的各血清型人源RVVP7蛋白的基因序列，利用Oligo 6．0软件设计上、下游引物;并经DNA Star软件证实其具有较好的特异性后，送上海生工生物技术有限公司合成;③取PCR反应管依次加入RNA模板(2μl)、DEPC 水(3μl)、分型引物混合物(1．5μl)、DMSO(2μl)后，充分混匀，在97℃变性5min，迅速置冰浴上冷却。向PCR管中加入反转录和PCR反应所需的试剂。反应条件设定为:42℃30min，94℃ 2min，94℃预变性1min，30 个循环(94℃变性30s，42℃退火2min，72℃延伸1min)，最后72℃延伸1min。反应完毕，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

4．一步法RT-PCR扩增RVVP7基因全长片段:参照GenBank上发表的人源轮状病毒VP7蛋白的序列(Access number:K02033)，利用Oligo 6．0软件设计一对特异性引物(上游引物:5'-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3';下游引物:5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3')。通过一步法RT-PCR扩增RVVP7基因全长片段。反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。

5．目的片段的测序及分析［3］:用Geneaid胶回收试剂盒回收和纯化DNA，将胶回收纯化后PCR产物进行测序并序列的分析。

结 果

1．腹泻标本的RV阳性检测结果:A组轮状病毒ELISA试剂盒检测结果显示，288例腹泻标本中有177例为RV阳性，其中儿童152例，成人19例。

2．一步多重RT-PCR结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示，在749bp、652bp、374bp位置上分别出现了特异的DNA条带，这3条带与 G1、G2、G3型 VP7基因的理论值相一致(图1)。由此得出，177例RV阳性标本中有73例为 G1型 (41．2%)，12例为 G2型(6．7%)，67 例为 G3型 (37．9%)。此外，还出现了25例 G1与 G3混合型(14．1%)。

图1 RVVP7基因型别RT-PCR扩增结果

3．一步法RT-PCR结果:对177例RV阳性标本的VP7基因全长进行RT-PCR扩增，经琼脂糖电泳鉴定，均在在1062bp处出现一条特异条带(图2)，与RVVP7基因全长的理论值一致。

图2 VP7基因片段RT-PCR扩增结果

4．RVVP7目的片段测序及序列比对结果:对177例RV阳性标本的RVVP7编码区的核苷酸序列进行分析、比对，结果见图3。有73例核苷酸序列同源性＞96．5%，且与G1型人轮状病毒Wa株的VP7核苷酸序列同源性≥95．7%;12例核苷酸序列同源性＞95．2%，与 G2型人轮状病毒 S2株的 VP7核苷酸序列同源性≥93．3%;67例核苷酸序列同源性＞95．5%，与G3型人轮状病毒SY9株的VP7核苷酸序列同源性≥92．5%;25例核苷酸序列同源性＞91．3%，与G1和G3混合型人轮状病毒P53株的核苷酸序列同源性≥90．5%。根据最新提出的VP7核苷酸序列同源性＞80%为同一基因型的原则，可进一步确定177例RV阳性的腹泻标本中，G1型73例，G2型为12例，G3型67例为;25例为G1和G3混合型［3］。

图3 轮状病毒阳性标本VP7血清型分析

讨 论

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，多呈散发性，3岁以前几乎所有儿童都曾感染过轮状病毒，早产儿、低出生体重儿及免疫缺陷患儿更容易患病。此外，约50%接触过RV感染患者的成人也可获得感染。现已证明，在世界范围内，导致婴幼儿腹泻的RV血清型主要为G1～G4型［4］。而且，这几种血清型之间存在着一定的交叉重组现象。此外，一些比较罕见的RV血清型如G9型、G5型已在某些国家地区呈流行趋势，我国个别地区如北京、上海等地的RV流行株中也出现了G9型［5～8］，这说明 RV流行株在世界范围内正呈现更为复杂的多样性。不同国家或同一国家的不同地区，RV血清型的分布均存在差异。即使同一地区的不同年份，RV血清型也可能存在差异。因此，对某地区轮状病毒VP7血清型的流行特点进行调查，获取可靠的流行病学数据，对RV感染性腹泻的诊治及指导RV疫苗研制与选用都将起到十分重要的作用。

本研究通过RT-PCR等分子生物学技术对大庆地区感染人的RV血清型做了一次流行病学调查，结果显示，288例腹泻患者中有177例为RV阳性。其中，197例儿童腹泻患者的标本中有152例RV阳性，阳性率为77．1%，91例成人腹泻患者，有19例为RV阳性，阳性率为20．9%。由此可见，成人RV阳性率明显低于儿童，说明RV主要侵袭免疫系统发育未完全的儿童，而成人对RV的感染有一定的抵抗力，所以发生率较低，符合RV流行病学特征。此外，本研究得出的儿童腹泻患者的RV阳性率稍高于其他地区，主要是因为本研究采集标本的时间多集中在秋冬季，腹泻患儿的年龄主要为5岁以下，这与其他国家报告的5岁以下患儿的RV感染率在60%～80%相一致［9］。RV血清型鉴定结果显示大庆地区近3年来流行的A组RV主要以G1型和G3型为主，分别占41．2%和37．9%，同时也存在少数的G2型。这与有关报道的中国其他地区轮状病毒血清型的检测结果多以G1和G3型为主是一致的，说明本地区流行的RV并未见新血清型的出现［10］;但与武汉、杭州等地区的主要RV流行株的血清型存在一些差异，说明我国各地区间RV的流行情况是有差异的，可能考虑与气候、环境等因素有关［11～13］。本研究同时发现有25例为G1和G3混合型，说明RV毒株在大庆地区已存在重组变异，这提醒我们在制定RV预防策略以及RV疫苗株的选用与研制上，应充分考虑当地RV的变异情况。本研究对大庆市区内感染人的RV血清型进行了鉴定，由于采集的标本在时间、区域等方面的局限性以及技术上的不成熟，可能会导致结果存在一定的误差，但为进一步开展大庆市婴幼儿轮状病毒腹泻的分子流行病学调查提供了必要的参考资料，同时也能为RV疫苗的选用提供可靠的理论依据。

1 邓富萍，陈宏君，黄欢．人轮状病毒的流行病学研究［J］．调查研究，2011，1(12):132-134

2 Cao XR，Akihara S，Fang ZY，et al．Genetic variation in the VP7 and NSP4 genes of human rotavirus serotype 3(G3 type)isolated in China and Japan［J］．Microbiol Immunol，1999，43(2):171-175

3 谢金鑫．大庆地区牛轮状病毒的分离及其全序列分析［D］．密山:黑龙江八一农垦大学，2009

4 Gentsch JR，Woods PA，Ramachandran M，et al．Review of Gand Ptyping results from a global collection of rotavirus［J］．Infect Dis，1996，174(suppl 1):30-36

5 Ramachandran M，Das BK，Vij A，et al．Unusual diversity of human rotavirus G and P genotypes in India［J］．Clin Miciobiol，1996，34:436-439

6 Gouvea V，Castro L，Timenetsky MDC，et al．Rotavirus Serotype G5 associated with diarrhea in Brazilian children［J］．Clin Microbiol，1994，32:1408-1409

7 董慧瑾，钱渊，张又．北京地区2007～2008年G9型A组人轮状病毒VP7和VP4基因分析［J］．中华流行病学杂志，2009，30(11):1179-1183

8 Zhang YX，Zhu QR，Zeng M．Molecular epidemiology of rotavirus among infants and young children with nosocomial diarrhea in Shanghai area［J］．Chinese J Infect Diseases，2009，27(1):18-22

9 Nguyen TV，Le Van P，Le Huy C，et al．Diarrhea caused by rotavirus in children less than 5 years of age in Hanoi，Vietnam［J］．J Clin Microbiol，2004，42(12):5745-5750

10 徐倏燊，温乐英，王健伟，等．中国部分城市A组轮状病毒感染状况调查及VP7血清型分析［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2001，15(1):77-80

11 唐少文，王斌，李燕，等．婴幼儿腹泻A组轮状病毒VP7基因型别的研究［J］．华中医学杂志，2004，28(2):73-74

12 李丹地，于秋丽，齐顺祥，等．河北省卢龙地区2008～2009年度轮状病毒流行病学研究［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2010，24(1):2-4

13 张永为，孟丽，杨叶青，等．杭州地区腹泻婴幼儿A群轮状病毒感染特征［J］．浙江预防医学，2012，24(12):60-62