心肌特异性启动子引导的rNIS基因的摄碘动力学研究

刘 影 于 涛 林 伟 邬恒夫

心肌梗死发生率和病死率呈逐年上升的趋势，尽管各种治疗方法在不断发展，由心肌梗死导致的难以治疗的心力衰竭及死亡仍然是全球面临的难题。近年出现的干细胞治疗心肌梗死成为研究的热点，各种监测干细胞转归的方法中又以核素的报告基因显像最有发展前途。

钠/碘转运体(sodium/iodide symporter，NIS)是正常甲状腺细胞的一种跨膜糖蛋白，介导碘的主动摄取，成为目前报告基因显像研究中最有发展前景的报告基因。已有大量研究以NIS作为报告基因的心脏干细胞显像研究，其存在的主要问题是转染心肌细胞后表达量较低，应用于临床实践受到限制，其中改善的主要方法包括应用组织特异性启动子来增加心肌组织靶向调控NIS基因的表达。肌凝蛋白轻链蛋白-2(myosin light chain-2，MLC-2p)为心肌特异性启动子。本研究构建了MLC-2p启动子调控的rNIS基因重组腺相关病毒(recombinant adenoassociated virus，rAAV)并感染心肌细胞，通过细胞水平的碘摄取实验，在体外证实NIS作为报告基因的可行性，为下一步的MLC-2p启动子调控的rNIS基因介导干细胞治疗心肌梗死的体内实验打下基础，现报道如下。

材料与方法

1．材料:载体质粒 pAAV-IRES-ZsGreen，JM109 感受态及HET kit(深圳百恩维生物科技有限公司)，乳腺癌细胞株MCF-7由本实验室保存，小量质粒抽提试剂盒及Trans2K PlusⅡ DNA Marker(北京全式金生物公司)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega公司)，DNA引物合成及测序，DMEM培养基，胎牛血清FBS，胰蛋白酶Trypsin 0．25%EDTA(美国Invitrogen公司)，限制性内切酶EcoRⅠ，MluⅠ，SpeⅠ及T4 DNA Ligase(美国NEB公司)，大规模质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)，Bio-Rad DNA电泳系统，Sub-Cell GT Cell电泳槽，Bio-Rad凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)，超低温冰箱(-80℃)，UTL2186-6V(美国Thermo公司)，超净工作台BCM-1600A(苏州苏净安泰公司)，落地式培养摇床(美国Thermo公司)，超微量高精度分光光度计Nanodrop ND-2000(美国Thermo公司)，METTLER PH 计 SevenMulti，S40(德国 METTLER TOLEDO公司)，Na125I为北京原子高科股份有限公司产品。SN-697型全自动双探头放射免疫γ计数器(105103)为上海核所日环光电仪器有限公司产品。正常SD大鼠乳鼠(1～3天龄)，雌雄不拘，由广东省动物实验中心提供。

2．方法:(1)pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen载体质粒构建:载体质粒pAAV-IRES-ZsGreen及目的基因rMLC-2p的EcoRⅠ+MluⅠ双酶切，分别回收质粒pAAV-IRESZsGreen酶切大片段和目的基因酶切产物并连接，连接产物与100μl JM109感受态细菌混匀转化，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并分别用EcoRⅠ+MluⅠ做酶切鉴定，可得到pAAV-rMLC-2p-ZsGreen载体质粒。同法，载体质粒pAAV-rMLC-2p-IRES-ZsGreen及目的基因rNIS的EcoRⅠ+SpeⅠ双酶切，分别回收质粒pAAV-IRES-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切产物并连接，连接产物转化，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并分别用MluⅠ+SpeⅠ做酶切鉴定，可得到pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen载体质粒。同法构建pAAV-CMV-rNIS-ZsGreen载体质粒。(2)重组腺相关病毒包装及效价测定:用胰酶消化收集293AAV细胞，以适当完全培养基稀释细胞至2×106/ml。接种2．5ml细胞稀释液至10cm培养皿，添加培养基至10ml。将细胞置于含5%，CO2的37℃培养箱中孵育8～24h，当细胞贴壁后即可开始转染。转染前2h换液。用HET转染试剂盒转染目的质粒到细胞，按试剂盒说明书操作。获得rAAV9-rMLC-2p-rNIS及对照病毒rAAV9-CMV-rNIS。(3)乳鼠原代心肌细胞及MCF-7细胞培养:无菌条件下取SD大鼠乳鼠心室肌，PBS中漂洗3次，剪成约1mm3的小块，加入胶原酶溶液(每克心肌组织约10ml)，于37℃恒温培养箱中温育消化，5h后将细胞悬液离心(800r/min，7min)，并用含10%新生牛血清的DMEM-F12漂洗两次，收集心肌细胞，置于37℃，5%CO2的培养箱中，1h后经差速贴壁法去除成纤维细胞，再接种入合适培养板。可获得心肌细胞纯度为(93．12±1．38)%。MCF-7细胞培养于含10%新生牛血清的DMEM-F12中，加入浓度100U/ml青链霉素双抗，于37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养。(4)重组腺相关病毒转染心肌细胞及MCF-7细胞:心肌细胞及MCF-7细胞均匀接种于24孔板，培养至细胞数为5×105/孔时准备转染。rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS以感染复数(multiplicity of infection，MOI=50)分别转染两种细胞并孵育，6h后将病毒液替换为含10%新生牛血清的新鲜培养基，继续培养至24h用于后续实验。空白对照组以等体积PBS代替病毒液，其他实验条件与实验组相同。(5)Na125I的动态摄取实验:已转染病毒的心肌细胞及MCF-7细胞，弃培养液，冰 PBS洗2次，每孔加入含Na125I18．5kBq的DMEM完全培养基0．5ml，在37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养 5、10、20、30、60、90 和 120min 时，弃培养液，用冰PBS洗2次，加入 0．3mol/L NaOH 裂解细胞 0．5ml(冰上操作)，收集裂解液至测量管。用SN-697型全自动双探头放射免疫γ计数器测量各管的每分钟放射性计数(count per minute，CPM)值。每种病毒每个时间点设3个复孔。(6)测定细胞的NaClO4抑制情况:心肌细胞接种于24孔板，培养至细胞数为5×105/孔时，加入MOI=50的rAAV9-rMLC-2prNIS孵育，6h后将病毒液替换为含10%新生牛血清的新鲜培养基，继续培养至24h，每孔加入含 Na125I18．5kBq的 DMEM完全培养基0．5ml，实验分两组，一组每孔含50μmol/L的Na-ClO4，另一组不加入NaClO4。37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养30min。弃培养液，冰PBS洗2次，裂解细胞并测量放射性。每组设3个复孔。

3．统计学方法:用SPSS 13．0进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，所有数据用方差分析进行比较，P＜0．05认为差异有统计学意义。

结 果

1．重组腺相关病毒鉴定:经EcoRⅠ和MluⅠ双酶切，并连接，转化后小量抽提质粒，并分别用EcoRⅠ和MluⅠ酶切鉴定，结果显示阳性克隆可酶切到275bp的条带，与rMLC-2p启动子片段大小相符。经EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切，并连接，转化后小量抽提质粒，并分别用MluⅠ和SpeⅠ酶切鉴定，结果显示阳性克隆可酶切到2100bp的条带，与rNIS基因的片段大小相符，提示pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRESZsGreen载体质粒构建成功(图1)。

图1 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen酶切鉴定结果

2．rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS重组腺相关病毒包装后绿色荧光信号的观察及效价测定:rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS转染293AAV细胞，观察细胞绿色荧光表达(图2)。初次收集病毒效价低，需多次反复感染293AAV细胞，随着病毒效价的增加，293AAV细胞出现病变现象时间缩短，一般在感染后24h即可见细胞病变现象，细胞肿胀、变圆、脱落、聚集成团。48h可见大多数细胞有绿色荧光。效价测定结果为 rAAV9-rMLC-2p-rNIS 2．46 ×1012μg/ml，rAAV9-CMV-rNIS 4．21 ×1012μg/ml。

图2 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen

3．Na125I的动态摄取实验:(1)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌细胞组Na125I摄取的摄取随时间逐渐增加，30min达高峰，随后进入平台期。故后面的摄取实验均采用30min的孵育时间。(2)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌细胞的Na125I摄取明显高于MCF-7细胞，感染rAAV9-rMLC-2prNIS的MCF-7细胞Na125I摄取与对照组PBS相似，证实了rMLC-2p启动子的心肌特异性。(3)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌细胞摄碘曲线相似，但CMV启动子介导的NIS摄取峰值较rMLC-2p启动子介导的低，进一步证实了rMLC-2p启动子的心肌特异性。(4)PBS对照组未见明显的Na125I摄取(图3)。

图3 Na125I动态摄取实验时间-放射性曲线

4．NaClO4抑制实验:经转染的心肌细胞在18．5kBq Na125I的环境中孵育30min后，转染组在加入NaClO4的情况下，心肌细胞摄碘明显受抑制(F=2894．3，P ＜0．05)，抑制率约为 90．3% ～92．5%，表明心肌细胞表达的NIS蛋白具有被NaClO4抑制的特性(图4)。

图4 NaClO4抑制碘摄取实验

讨 论

自从1996年大鼠和人类的NIS基因被克隆后［1］，其分子特征得到了广泛的研究，更成为近年来基因和干细胞治疗人类各种难治性疾病中报告基因监测中最有发展前途的报告基因［2］。已有大量研究证实NIS报告基因在心脏疾病的可行性［3～5］。Terrovitis等［3］的研究结果没有对细胞的存活、增殖、心脏原性的动作电位和血管生成能力产生不利的影响。另外，体外分析也证实Ad-NIS基因转导后无任何心肌的损伤或无功能［4］。

在心脏干细胞治疗中，高的转染效率及安全的载体是非常必要的，目前应用的载体主要有病毒载体和非病毒载体。应用病毒介导转导法是迄今在转干细胞入心脏中应用得最多的转导载体。rAAV的优点在于:可持续性，可确保长期稳定指导转基因表达，不编码病毒蛋白，为非免疫原性及可转导像心肌这样的非分裂性细胞等，对人类相对较安全，因而更适合作为人类心梗干细胞移植治疗的转导载体［6］。

治疗干细胞的组织特异性表达是干细胞治疗中的关键问题之一。启动子是报告基因的转录控制元件，能启动和调节报告基因表达，可分为持续的启动子、可诱导的启动子及组织特异性启动子。组织特异性启动子的应用能调控目的基因在特定的组织或肿瘤中表达，实现药物的组织特异性毒性效应最大化并降低不良反应。目前应用组织特异性启动子如前列腺特异抗原(PSA)启动子、Egr-1启动子、上皮黏蛋白(MUCI)启动子、免疫球蛋白启动子和增强子、CEA启动子、降钙素启动子、hTERT核心启动子等靶向调控人 NIS基因的表达介导131I治疗肿瘤［7～13］。心脏组织特异的启动子MLC-2p可选择性的在心肌组织表达，减少心脏外(包括甲状腺和胃)的活性，从转录水平调控NIS在心脏的表达。

本研究证实了rAAV9-rMLC-2p-rNIS构建成功，并在体外心肌细胞特异性高表达，可以介导NIS的摄碘特性，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌细胞的 Na125I摄取明显高于 MCF-7细胞，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌细胞摄碘曲线相似，但CMV启动子介导的NIS摄取峰值较rMLC-2p启动子介导的低，证实了rMLC-2p启动子的心肌特异性，且NaClO4能特异性地抑制心肌细胞对碘的摄取，证实转染细胞表达的rNIS蛋白是有功能的。为进一步以MLC-2p为启动子，调控的rNIS基因的重组腺相关病毒的体内实验打下基础。

1 Dai G，Levy O，Carrasco N．Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter［J］．Nature，1996，379(6564):458-460

2 Joseph C Wu．Molecular imaging antidote to cardiac stem cell controversy［J］．J Am Coll Cardiol，2008，52(20):1661-1664

3 Terrovitis J，Kwok KF，Lautamäki R，et al．Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography［J］．J Am Coll Cardiol，2008，52(20):1652-1660

4 Lee KH，Bae JS，Lee SC，et al．Evidence that myocardial Na/I symporter gene imaging does not perturb cardiac function［J］．J Nucl Med，2006，47(11):1851-1857

5 胡硕，兰晓莉，曹卫，等．利用报告基因rNIS监测大鼠间充质干细胞移植大鼠心肌的可行性研究［J］．中华核医学杂志，2010，30(3):180-184

6 Schirmer JM，Miyagi N，Rao VP，et al．Recombinant adeno-associated virus vector for gene transfer to the transplanted rat heart［J］．Transpl Int，2007，20(6):550-557

7 Spitzweg C，O'Connor MK，Bergert ER，et al．Treatment of prostate cancer by radioiodine therapy after tissue-specific expression of the sodium iodide symporter［J］．Cancer Res，2000，60(22):6526-6530

8 吴强乐，许袁琦，黄宏，等．Egr-1启动子调控hNIS基因的重组质粒构建及转染细胞株的建立［J］．苏州大学学报:医学版，2012，32(6):769-773

9 Dwyer RM，Berger ER，O'Connor MK，et al．In vivo radioiodide imaging and treatment of breast cancer xenografts after MUC1-driven expression of the sodium iodide symporter［J］．Clin Cancer Res，2005，11(4):1483-1489

10 Dingli D，Diaz RM，Bergert ER，et al．Genetically targeted radiotherapy for multiple myeloma［J］．Blood，2003，102(2):489-496

11 Scholz IV，Cengic N，Baker CH，et al．Radioiodine therapy of colon cancer following tissue-specific sodium iodide symporter gene transfer［J］．Gene Ther，2005，12(3):272-280

12 Cengic N，Baker CH，Schutz M，et al．A novel therapeutic strategy for medullary thyroid cancer based on radioiodine therapy following tissue-specific sodium iodide symporter gene expression［J］．J Clin Endocrinol Metab，2005，90(8):4457-4464

13 赵兴业，李玮，谭建，等．hTERT启动子引导hNIS基因重组腺病毒介导放射性核素的裸鼠显像［J］．天津医科大学学报，2012，18(4):422-424