Mus81和GEN1基因在肺癌组织中的表达及其临床意义

喻光懋 吴云路 钱 颖 董学君

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发生率逐年增加，其疗效一般均较差，除手术难以清除外，术后化疗耐药是重要原因。肿瘤化疗耐药尚无理想的对策，其重要原因在于耐药机制及重要分子不甚明了，因此是当前研究的热点之一。对于通过损伤DNA来杀死肿瘤细胞的药物，其耐药性与DNA损伤修复相关分子及其表达有关，并得到普遍认同。Mus81和GEN1是近年被发现的与DNA修复相关的新基因。李婵媛等［1］报道，Mus81在喉癌中表达下调，并认为Mus81下调与喉癌发生具有显著相关性。本研究组以往对乳腺癌的研究结果表明，乳腺癌患者病灶组织Mus81表达明显低于相应的癌旁组织，有研究发现Mus81表达异常与耐药性相关［2］。Turnbull等［3］报道，GEN1基因在乳腺癌病灶组织和相应癌旁组织表达无显著差异。而Kuligina等［4］认为，GEN1突变是乳腺癌易感的隐性标志。

由此可见，Mus81和GEN1基因在部分肿瘤中表达有特异性改变，并显示其改变与化疗耐药相关，但肺癌中的相关研究报道较少。本研究目的是了解肺癌组织中，Mus81和GEN1是否与其他肿瘤一样有表达上的改变，并探讨其对肺癌诊断和治疗的潜在临床价值及二者表达是否存在相关性。

材料与方法

1．材料:(1)临床资料:收集肺癌患者手术标本30例(包括病灶组织和相应的癌旁组织)。所有标本均来源于笔者医院心胸外科，肺癌患者年龄41～80岁，平均年龄64岁。患者术前均未经放化疗，病理诊断均经两位病理医师确诊。(2)主要仪器:NANO DROP2000分光光度计购自美国Thermo公司，Anthos 2010酶标仪购自英国Anthos公司，琼脂糖电泳仪购自上海复日科技公司，凝胶电泳成像系统购自美国Gibco公司，定性PCR仪、Western blot电泳仪电源、垂直电泳仪、转移电泳槽均购自美国 Bio-Rad公司。(3)主要试剂:E．Z．N．A．ⓇTotal DNA/RNA/Protein Kit购自美国Omega公司，Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自北京Solarbio公司，cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒均购自美国 Biomiga公司，β-actin、Mus81、GEN1上下游引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成，β-actin鼠抗人一抗、Mus81鼠抗人一抗、GEN1兔抗人一抗、HRP兔抗鼠二抗、HRP羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司，ECL化学发光A、B液购自上海Beyotime公司。

2．方法:(1)标本处理:标本用装有一次性无菌袋的0℃保温瓶收集，收集后20min内用生理盐水冲洗、分装，并立刻置于液氮中速冻，之后迅速转存于-80℃冰箱中保存备用。(2)Mus81和GEN1 mRNA达表的检测:1)组织总RNA的抽提:取大约500mg新鲜组织加入液氮充分研磨后，按说明书加入 E．Z．N．A．ⓇTotal DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取组织总RNA。提取出的总RNA用Thermo NANO DROP2000分光光度计测定浓度及纯度，OD260/OD280在1．8～2．0之间为最佳。2)RT-PCR:按照cDNA第一链合成试剂盒(Biomiga)说明书，将5μg总RNA反转录成cDNA，之后进行 PCR反应。所用引物序列如下:Mus81上游引物:5'-TGTGGACATTGGCGAGAC-3'，下游引物:5'-GCTGAGGTTGTGGACGGA-3'(产物长度319bp);GEN1上游引物［5］:5'-CCACATGACTATGAATACTGCTGTCCTT-3'，下游引物:5'-TGGGAATCCCTCACAACAGCAAGC-3'(产物长度116bp);β-actin上游引物:5'-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3'，下游引物:5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'(产物长度 108bp)。PCR 反应体系 20μl，包括 Taq MasterMix 10μl、上下游引物各1μl、cDNA 1μl、去离子水 7μl。PCR 反应条件:94℃ 预变性90s，然后 94℃30s、55℃30s、72℃1min，30 个循环，最后 72℃ 终延伸5min。取5μl PCR终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。使用ChemiDocTMXRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)进行灰度扫描、Quantity One-4．6．2分析结果。以同一标本Mus81以及GEN1基因mRNA条带与内参基因β-actin mRNA条带的光密度比值作为该基因的相对表达量。(3)Mus81和GEN1基因蛋白表达的检测:取新鲜组织约500mg按照说明书加入 E．Z．N．A．ⓇTotal DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取组织总蛋白。使用Anthos 2010酶标仪结合Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio)测定蛋白浓度，根据蛋白浓度调整每孔蛋白上样量，使每孔总蛋白量保持一致。100V恒压，SDS-PAGE电泳2h;300mA恒流，转膜1h。转膜完成后用丽春红染液(Solarbio)染色5min，蒸馏水洗去残留染液。1×TBST洗膜5分/次×3次后，5%脱脂奶粉室温封闭2h，1×TBST洗膜15分/次×3次，然后分别加入β-actin鼠抗人抗体(1∶3000，Abcam)、Mus81 鼠抗人抗体(1∶1000，Abcam)、GEN1羊抗兔抗体(1∶75，Abcam)，4℃孵育过夜。弃一抗，1×TBST洗膜15分/次×3次。β-actin和Mus81组加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠二抗(1∶10000，Abcam)，GEN1组加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1∶20000，Abcam)，室温孵育1h。弃二抗，1×TBST洗膜15分/次 ×3次。最后滴加ECL化学发光A、B液(Beyotime)，曝光、显影、定影。使用ChemiDocTMXRS凝胶成像系统进行灰度扫描、Quantity One-4．6．2分析结果，以同一标本Mus81以及GEN1蛋白条带与β-actin蛋白条带的光密度比值作为该蛋白的相对表达量。

3．统计学方法:采用统计软件SPSS 17．0分析数据，计量资料用均数±标准差(±s)表示。t检验比较癌组织、癌旁组织Mus81及GEN1表达量的差异。Spearman相关分析检测Mus81和GEN1表达水平的相关性。所有检验均采用双侧检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．肺癌病灶组织及癌旁组织Mus81 mRNA和蛋白的表达:在肺癌组织中，Mus81 mRNA的平均相对表达量(0．365 ±0．098)低于相应癌旁组织(0．455 ±0．123)，差异有统计学意义(t=-3．529，P ＜0．05)(图1、图3)。Mus81蛋白平均相对表达量(1．046±0．121)低于相应癌旁组织(1．341 ±0．190)，差异有统计学意义(t=-4．273，P ＜0．05，图2、图4)。

2．肺癌病灶组织和癌旁组织GEN1 mRNA和蛋白的表达:肺癌组织中，GEN1 mRNA的平均相对表达量(0．420 ±0．111)与相应癌旁组织(0．455 ±0．123)相比，差异无统计学意义(t=-2．006，P ＞0．05，图1、图3)。GEN1蛋白平均相对表达量(0．769±0．188)同相应癌旁组织(0．719±0．148)相比，差异无统计学意义(t=0．957，P ＞0．05，图2、图4)。

图1 肺癌组织和癌旁组织中Mus81以及GEN1 mRNA表达水平

图2 肺癌组织和癌旁组织中Mus81以及GEN1蛋白表达水平

图3 肺癌组织和癌旁组织中Mus81以及GEN1 PCR电泳结果

3．肺癌Mus81和GEN1表达的相关性:Spearman相关分析得出，30例肺癌组织中，Mus81表达水平和GEN1表达水平无直线相关关系(P＞0．05)，但在Mus81高表达的6例肺癌组织中，Mus81的表达水平和GEN1的表达水平呈正相关。

讨 论

现有的研究认为，Mus81是一种抑癌基因，其编码的蛋白属于XPF核酸内切酶家族，在DNA修复及分解霍利迪连接体上具有重要作用［6］。本组30例肺癌病灶组织及癌旁组织的对照研究结果，Mus81 mRNA表达，肺癌病灶组织显著低于癌旁组织(P＜0．05)，Mus81蛋白表达的结果也有统计学差异(P＜0．05)，表明Mus81可能与肺癌的发生相关。Mus81具有DNA修复功能，因此推测可能的机制为Mus81表达下调降低了对正常细胞损伤DNA的修复，细胞不能及时识别处理受损DNA，导致细胞癌变，这与己明确DNA损伤可致癌的理论相符。喉癌、乳腺癌、肺癌中均见到类似结果，提示Mus81表达下调导致肿瘤发生可能是不同肿瘤的共同现象，但具体的机制尚不明确，因此，进一步了解Mus81在细胞中的作用机制，对了解肿瘤的发生过程具有十分重要意义。

图4 肺癌组织和癌旁组织中Mus81以及GEN1 Western blot结果

近年研究发现，GEN1作为XPG家族的新成员，具有分解霍利迪连接体，进而保证DNA顺利修复的功能，并且GEN1和Mus81存在着密切关系，两者共同影响细胞中霍利迪连接体的分解及DNA修复［7，8］。Wood 等［9］运用“基因组地形”技术，发现 2例乳腺癌患者的GEN1基因存在突变，并认为GEN1可能是一种新的抑癌基因。Turnbull等［3］通过分析乳腺癌患者以及对照组GEN1的表达认为，GEN1的表达情况和乳腺癌的发生没有明显关系。与此不同，Kuligina等［4］认为，GEN1在单侧乳腺癌患者的体内表达较对照组高(P=0．031)，但双侧乳腺癌患者同对照组比差异无统计学意义。尚未发现GEN1在肺癌中表达情况的相关报道。鉴于GEN1和Mus81存在着密切关系，为此本研究进行这二基因的联合分析，结果显示，GEN1 mRNA和蛋白的表达水平，在肺癌和相应的癌旁组织中无统计学差异，这一结论和Turnbull等［3］的报道相一致，提示在肺癌的发生、发展过程中，GEN1的作用可能并不是主要的，而之前也有学者认为GEN1作为Mus81的替代基因而存在［10］。本研究30例肺癌组织中，Mus81和GEN1的表达没有明显的相关性，可能的原因是Mus81和GEN1之间，尚有其他中间相关因子发挥作用。但是在Mus81高表达的6例肺癌组织中，Mus81的表达水平和GEN1的表达水平呈正相关，这一结论或许可以从侧面证明Mus81和GEN1共同影响着细胞DNA的修复［8］。

综上所述，肺癌组织中Mus81的表达低于癌旁组织，提示Mus81的表达下调可能和肺癌的发生有关;结合之前相关报道，提示Mus81表达下调可能是不同肿瘤普遍存在的现象;GEN1在肺癌组织中的表达水平同癌旁相比无统计学差异，这提示GEN1在肿瘤的发生、发展过程中并未起主要作用。Mus81表达水平和GEN1表达水平无明显相关性。本研究观察到Mus81异常表达与乳腺癌化疗耐药相关，但在肺癌中的相关性有待于进一步验证。

1 李婵媛，王淑云，袁海明，等．Mus81基因在喉癌中的突变和表达［J］．中华医学遗传学杂志，2008，25(5):560-565

2 钱颖，张帆，倪晓妍，等．Mus81基因在乳腺癌中的表达及其意义［J］．中华实验外科杂志，2013，30(6):1313

3 Turnbull C，Hines S，Renwick A，et al．Mutation and association analysis of GEN1 in breast cancer susceptibility［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，124(1):283-288

4 Kuligina ES，Sokolenko AP，Mitiushkina NV，et al．Value of bilateral breast cancer for identification of rare recessive at-risk alleles:evidence for the role of homozygous GEN1 c．2515_2519delAAGTT mutation［J］．Fam Cancer，2013，12(1):129-132

5 Wechsler T，Newman S，West SC．Aberrant chromosome morphology in human cells defective for Holliday junction resolution［J］．Nature，2011，471(7340):642-646

6 Agmon N，Yovel M，Harari Y，et al．The role of Holliday junction resolvases in the repair of spontaneous and induced DNA damage［J］．Nucleic Acids Res，2011，39(16):7009-7019

7 Ishikawa G，Kanai Y，Takata K，et al．DmGEN，a novel RAD2 family endo-exonuclease from Drosophila melanogaster［J］．Nucleic Acids Res，2004，32(21):6251-6259

8 Rass U，Compton SA，Matos J，et al．Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein［J］．Genes Dev，2010，24(14):1559-1569

9 Wood LD，Parsons DW，Jones S．The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers［J］．Science，2007，318(5853):1108-1113

10 Ho CK，Mazón G，Lam AF，et al．Mus81 and Yen1 promote reciprocal exchange during mitotic recombination to maintain genome integrity in budding yeast［J］．Mol Cell，2010，40(6):988-1000