近红外双荧光系统在磷酸酯酶筛选中的应用

杨昕霆 阎海霞 沈珝琲 张 业

奥德赛(Odyssey)近红外双荧光扫描系统是近年来引进的一种新技术。近红外双荧光扫描系统的工作原理是使用激光激发带有特殊标记的抗体或者荧光染料，受激发的抗体或染料释放出近红外荧光，样品发射出的700nm和800nm近红外荧光信号可以被扫描仪器接收，并且计量近红外荧光值，从而完成蛋白质的定性或定量测量。这种测量方式可以精确测定局部的蛋白质含量，并且可以通过计算总荧光量完成定性定量实验。

KDM3A是JHDM2去甲基化酶家族中最早发现的成员，能够去除组蛋白 H3K9的单甲基和双甲基［1］。研究表明，KDM3A能够影响精子的发生，参与脂肪代谢及多种癌症的发生过程［2～4］。

近红外双荧光扫描系统可以完成多种蛋白质定性定量实验，尤其是在ICW(in cell western)中有着独特的优势。本实验初步证明了KDM3A能够发生去磷酸化修饰，并且利用奥德赛近红外双荧光扫描系统初步筛选到4种PP1与PP2磷酸酯酶家族中可能参与蛋白KDM3A去磷酸化过程的磷酸酯酶亚基。

材料与方法

1．主要材料与试剂:磷酸化KDM3A抗体于MBL公司订购。DRAQ5细胞核染料为Cell Signalling Technology产品。近红外双色荧光Phospho-EGFR Tyr104为LI-COR产品。转染试剂Vigofect为威格拉斯生物技术公司产品。冈崎酸OA为Sigma公司产品。磷酸酯酶RNAi干扰文库由哈佛医学院Martin E．Dorf教授惠赠。

2．细胞系:HEK293T细胞系为本课题组保留。

3．细胞培养:用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

4．细胞转染:转染24h前接种HEK293T细胞，细胞汇合度达60%～80%时进行转染。根据Vigofect转染试剂说明书将磷酸酯酶干扰质粒瞬时转染入HEK293T细胞中。转染6h后更换新鲜培养液，36～48h后收取细胞进行后续实验。

5．细胞免疫荧光:赖氨酸包被盖玻片10min，PBS冲洗3次，紫外照射1h。接种细胞，待细胞汇合度达60% ～80%时进行转染。转染6h后，更换含有一定浓度OA的新鲜DMEM培养液继续培养细胞。36h后，用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液固定细胞10min，PBS漂洗3次;用0．2%Triton X-100透化细胞15min，PBS漂洗3次。加入含1%BSA的PBS缓冲液37℃静置30min，封闭非特异性抗原表位。封闭结束后，将相应的特异性抗体按照一定稀释比例加入缓冲液中，于4℃杂交过夜。孵育结束后用PBS洗3次。加入带有荧光标记的二抗，室温孵育1h，PBS洗 3次。DAPI工作液染细胞核5min，PBS冲洗后封片，用激光共聚焦显微镜进行观察。

6．细胞近红外双荧光扫描:将HEK293T细胞接种于96孔板，待细胞汇合度达60% ～80%时转染细胞。细胞培养24h后用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液固定细胞10min，PBS漂洗3次;使用0．2%Triton X-100透化细胞15min，PBS漂洗3次。Odyssey封闭液室温处理细胞30min，封闭非特异性抗原。封闭结束后，加入磷酸化KDM3A的抗体4℃杂交过夜;用含0．1%Tween-20的PBS缓冲液漂洗3次。加入近红外荧光二抗Phospho-EGFR Tyr1045室温孵育1h;PBS缓冲液漂洗3次。用近红外荧光染料DRAQ5染细胞核5min，PBS漂洗后使用近红外荧光扫描仪进行扫描分析。

结 果

1．免疫荧光验证KDM3A去磷酸化过程:冈崎酸OA(Okazaki acid)是磷酸酯酶PP1和PP2的广谱抑制剂，不同浓度的OA可以抑制不同家族磷酸酯酶的活性［5，6］。免疫荧光结果表明未经OA处理的对照组HEK293T细胞中仅有极微弱的荧光信号;高浓度(15nmol/L)OA处理的实验组HEK293T细胞中出现明显增强的荧光信号(图1)。本实验初步证明在HEK293T细胞中存在KDM3A的去磷酸化过程。

图1 冈崎酸OA(15nmol/L)处理后HEK293T细胞中存在KDM3A的去磷酸化过程(免疫荧光，×100)

2．抗体浓度优化:将磷酸化KDM3A的一抗及二抗按照不同比例进行稀释。不同稀释比例的抗体杂交后进行近红外双荧光扫描。将扫描所得数值绘制成柱形图(图2)。结果表明，抗体浓度过高时，扫描值会溢出;抗体浓度过低时，检测灵敏度下降，背景值过高。后续实验按照磷酸化KDM3A一抗 1∶400，二抗 Phospho-EGFR Tyr1045 1∶800 的稀释比例进行。

图2 抗体浓度优化

3．利用磷酸酯酶RNAi干扰文库筛选KDM3A的去磷酸化磷酸酯酶:将PP1和PP2磷酸酯酶家族蛋白的RNAi干扰文库(共357个干扰质粒)转染入HEK293T细胞，OA处理24h后进行ICW实验，每个干扰质粒设置3个复孔。通过近红外双荧光系统进行扫描(图3)，将OA处理的实验组与未处理的对照组荧光比值进行对比，分析发现其中4种磷酸酯酶亚基(表1)的荧光强度比值较高，推测这几种磷酸酯酶亚基在KDM3A去磷酸化过程中可能起到关键作用。

图3 冈崎酸处理转染磷酸酯酶RNAi干扰文库的HEK293T细胞远红外双荧光扫描图

讨 论

去甲基化酶KDM3A最早是在减数分裂和减数分裂后期雄性精子的cDNA文库中发现的，是一种H3K9单甲基化和双甲基化的去甲基化酶［7］。越来越多的研究表明，KDM3A不仅在激素诱导的基因转录调控中起着重要作用，还参与生物体发育与疾病等多种重要的生理病理过程［8，9］。KDM3A能够通过调控HOXA1基因的转录来调控肿瘤细胞的细胞周期［10］。KDM3A的缺失会导致精子细胞染色质凝聚过程异常，最终造成雄性小鼠不育［11］。KDM3A能够去除干性基因Tcl1、Tcfcp211和Zfp57等基因启动子的H3K9二甲基化，从而维持细胞的干性［12］。

表1 可能参与KDM3A去磷酸化过程的磷酸酯酶亚基

本课题组以往工作发现在Jurkat细胞的热应激反应中KDM3A会发生特异位点的磷酸化，该位点磷酸化后KDM3A能够特异结合到某些免疫相关基因的启动子区，激活与热应激反应相关基因的表达。虽然KDM3A的磷酸化通路已经找到(待发表)，但其去磷酸化的过程及机制尚不明确。

实验首先通过磷酸酯酶抑制剂OA处理HEK293T细胞，初步证明PP1和PP2磷酸酯酶家族蛋白可能参与KDM3A去磷酸化过程。近红外双荧光扫描系统是最近几年的新技术，它能够利用激光激发近红外荧光信号，并且通过捕获这些信号对细胞内目标蛋白进行定量检测。近红外双荧光扫描系统可以快速的对高通量的目标蛋白进行定性与定量的分析，笔者利用近红外双荧光扫描系统初步筛选出4种可能参与KDM3A去磷酸化过程的磷酸酯酶亚基，进一步的鉴定需要更多的实验手段与方法来实现。KDM3A在精子的发生、脂肪代谢及多种癌症的发生过程中都发挥着至关重要的作用，研究KDM3A的磷酸化与去磷酸化修饰过程与机制将对多种疾病的治疗提供新的线索与靶点。

1 Klose RJ，Kallin EM，Zhang Y．JmjC-domain-containing proteins and histone demethylation［J］．Nat Rev Genet，2006，7(9):715-727

2 Okada Y．Histone demethylase JHDM2A is critical for Tnp1 and Prm1 transcription and spermatogenesis［J］．Nature，2007，450(7166):119-123

3 Okada Y，Tateishi K，Zhang Y．Histone demethylase JHDM2A is involved in male infertility and obesity［J］．J Androl，2010，31(1):75-78

4 Krieg AJ．Regulation of the histone demethylase JMJD1A by hypoxiainducible factor 1 alpha enhances hypoxic gene expression and tumor growth［J］．Mol Cell Biol，2010，30(1):344-353

5 Goris J．Okadaic acid，a specific protein phosphatase inhibitor，induces maturation and MPF formation in Xenopus laevis oocytes［J］．FEBS Lett，1989，245(1-2):91-94

6 Franchini A，Malagoli D，Ottaviani E．Targets and effects of yessotoxin，okadaic acid and palytoxin:a differential review［J］．Mar Drugs，2010，8(3):658-677

7 Yamane K．JHDM2A，a JmjC-containing H3K9 demethylase，facilitates transcription activation by androgen receptor［J］．Cell，2006，125(3):483-495

8 Yamada D．Role of the hypoxia-related gene，JMJD1A，in hepatocellular carcinoma:clinical impact on recurrence after hepatic resection［J］．Ann Surg Oncol，2012，19 Suppl 3:S355-364

9 Pedersen MT，Helin K．Histone demethylases in development and disease［J］．Trends Cell Biol，2010，20(11):662-671

10 Cho HS．The JmjC domain-containing histone demethylase KDM3A is a positive regulator of the G1/S transition in cancer cells via transcriptional regulation of the HOXA1 gene［J］．Int J Cancer，2012，131(3):E179-189

11 Inagaki T．Obesity and metabolic syndrome in histone demethylase JHDM2a-deficient mice［J］．Genes Cells，2009，14(8):991-1001

12 Ma DK．G9a and Jhdm2a regulate embryonic stem cell fusion-induced reprogramming of adult neural stem cells［J］．Stem Cells，2008，26(8):2131-2141