中国云南地区恒河猴群MHC-DRB部分等位基因的调查

和占龙 禹文海 杨凤梅 赵 远 鲁帅尧 王俊斌 陈丽雄 乞素冬 李艳艳 刘龙丁

恒河猴(Rhesus monkey，Macaca mulatta)，属灵长目(Primates)、类人猿亚目(Anthropoidea)、猴科(Cercopithecidae)、猕猴属(Macaca)，属于国家二级保护动物。其适应性强，容易驯养繁殖，生理上与人类较接近，因此是人类医学科研究工作中比较理想的实验动物，主要应用于传染病学、药理学、毒理学、行为学、老年病、器官移植、内分泌病、肿瘤学等方面研究。恒河猴MHC又称为RhLA(rhesus macque leukocyteantigen)，其MHC基因命名时加前缀Mamu(Macaca mulatta)，习惯上直接使用为Mamu。根据Mamu基因产物功能和结构的不同，又将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因。恒河猴的Mamu-Ⅱ类分子与人类一样，也有3个典型的亚区 DR、DQ、DP［1，2］。与 DQ、DP 相比，DR在细胞表面有较高的浓度，在免疫反应中具有重要作用。恒河猴DRB位点的多态性之高，是人类和其他灵长类动物中所没有的，已经发现的恒河猴DRB位点的等位基因有126个［3～6］。本研究以来源清晰的云南地区恒河猴为研究对象，应用PCR技术对部分MHC-DRB等位基因进行分析，为今后开展恒河猴群遗传资源保护及相关动物实验提供基础。

材料与方法

1．样品采集和DNA提取:实验采集云南地区普通级恒河猴全血共195份，其中昆明自繁猴123份、宁蒗县26份、景东县27份和镇沅县19份。均来源于中国医学科学院医学生物学研究所全国医学灵长类研究中心［实验动物许可证号:SCXK(滇)2010-0006］。静脉抽取全血2ml，EDTA抗凝。采用AXYGEN DNA提取试剂盒提取基因组DNA，详细操作步骤见说明书。

2．PCR扩增及测序:参考相关文献［7］选取引物对，引物序列见表1。由生工生物工程(上海)有限公司合成。在PCR仪(Bio-Rad C1000)中进行PCR扩增。反应体积为10μl，上游引物和下游引物各(20μmol/L)0．5μl，模板 DNA 0．5μl，2 ×PCR Master Mix 5μl，ddH2O 3．5μl。反应条件为 94℃ 4min，然后 94℃ 1min，64 ～66℃ 45s，72℃ 1min，35 个循环，最后 72℃延伸7min。用1．5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，参照DNA marker DL2000确定阳性样品。阳性样品PCR产物送上海杰李生物技术有限公司进行测序。

表1 MHC-DRB各等位基因引物序列

3．统计学方法:数据利用Excel和SPSS 13．0软件进行统计分析，采用卡方检验进行显著性分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．PCR 产物电泳结果:对 DRB1*0303、DRB1*0309、DRB1*0305/06、DRB1*0403、DRB1*1005/07、DRB3*0403、DRB5*0301/02、DRB6*0101、DRB6*0103、DRB6*0104/05、DRB*W101 和 DRB*W201 等12个基因进行PCR扩增，1．5%琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图及结合分子质量标准DL2000判断结果。本研究以DRB3*0403基因电泳图来说明，DRB3*0403基因PCR产物大小为243bp，与预期结果一致(图1)。由图1可以看出，第1、5、9、10号样品为阳性。

图1 恒河猴MHC-DRB3*0403基因的PCR扩增结果

2．DRB基因的序列分析结果:将 DRB各基因PCR扩增的部分阳性样品进行测序，经BLAST比对发现本研究中测定的序列与GenBank中对应序列同源性在92%以上。本研究以DRB3*0403基因测定的序列为例进行说明。DRB3*0403基因在GenBank中BLAST比对结果见图2，两者同源性为99%。对比发现本实验测定的序列在GenBank中对应序列(FJ544411)的227位碱基A突变成T、337位碱基C突变成G。

图2 DRB3*0403基因的对比结果

3．云南地区4个恒河猴群各基因的分布情况:云南地区4个恒河猴群各MHC-DRB基因分布情况见表2。

表2 云南地区4个恒河猴群MHC-DRB部分基因检测结果［n(%)］

由表2可知，宁蒗恒河猴群检测出了所有的12个基因，检出率为 3．85% ～57．69%，其中 DRB5*0301/02、DRB6*0104/05、DRB*W101 检出率最低(3．85%)，DRB6*0103 检出率最高(57．69%)。来自昆明的自繁猴群除了未检测出DRB*W201外，均检测出了其余所有的11个基因，检出率为1．63% ～42．28%，其中 DRB1*0303 检出率最低(1．63%)，DRB6*0101检出率最高(42．28%)。景东群未检测出DRB1*0403和DRB5*0301/02基因，其他基因的检出率为3．70% ～33．33%，其中 DRB*W101检出率最低(3．70%)，DRB3*0403、DRB6*0101、DRB6*0103检出率最高(42．28%)。镇沅群未检出DRB*W201、DRB1*0309和 DRB5*0301/02基因，其他基因检出率为5．26% ～63．16%，其中 DRB1*0303和DRB1*0403检出率最低(5．26%)，DRB6*0103 检出率最高(63．16%)。

卡方检验结果表明，DRB*W201在宁蒗群和昆明自繁猴群之间存在显著性差异(χ2=4．66，P＜0．05)，景东群与昆明自繁猴群之间差异有统计学意义(χ2=8．85，P ＜0．01)，其余各基因在 4 个恒河猴群之间差异无统计学意义(χ2＜3．84，P ＞0．05)。

讨 论

主要组织相容性复合体与机体免疫功能和机体对免疫相关疾病的抵抗力密切相关［8，9］。在抗原递呈过程中，MHCⅡ类分子参与胞外抗原向CD4+T细胞的递呈，大量研究表明许多疾病的进展过程与宿主的MHC基因型密切相关，许多有关MHCⅡ类分子在HIV-1病毒感染中的作用的报道说明其在控制病毒感染中具有重要作用［10］。

本研究利用PCR-SSP方法对195只云南地区恒河猴的外周血样品进行了检测，12个MHC-DRB基因在云南地区恒河猴群中均有检出，说明云南地区恒河猴遗传多样性较丰富。在本研究中检测出的12个基因PCR阳性样品测序比对与目标序列完全一致，说明PCR-SSP方法能较好的用于DRB各基因的分析，这有利于下一步开展大规模样品DRB基因携带情况分析，从而获得具有特定基因的恒河猴群筛选和选育提供了基础，为生物医学相关研究提供合适的具有特定遗传背景的实验动物提供依据。

1 Kenter M，Otting N，Anholts J，et al．Evolutionary relationships among the primate MHC-DQA1 and DQA2 alleles［J］．Immunogenetic，1992，36(2):71-78

2 Slierendregt BL，Otting N，Anholts J，et al．Gel electrophoretic analysis of rhesus macaque major histocompatibility complexⅡDR molecules［J］．Hum Immunol，1994:4033-4040

3 Doxiadis GG，Otting N，de Groot NG，et al．Unprecedented polymorphism of MHC-DRB region cofigurations in rhesus configurations in rhesus macaque［J］．J Immun，2000，164(4):3193-3199

4 Slierendregt BL，van Noort JT，Bakas RM，et al．Evolutionary stability of transpecies major histocompatibility complex classⅡDRB lineages in human and rhesus monkeys［J］．Hum Immunol，1992，35(1):29-39

5 Slierendregt BL，Otting N，Van Besouw N，et al．Expansion and contraction of rhesus macaque DRB region by duplication and deletion［J］．J Immunol，1994，52(5):2298-2307

6 Lekutis C，Letvin NL．Biochemical and molecular characterization of rhesus monkey major histocompatibility complex classⅡ DR［J］．Hum Immunol，1995，43(1):72-80

7 Lobashevsky A，Smith JP，Kasten-Jolly J，et al．Idengtification of DRB alleles in rhesus mokeys using polymerase chain reactionsequence-specific primers(PCR-SSP)amplification［J］．Tissue Antigens，1999，54:254-263

8 Bontrop RE，Watkins DI．MHC polymorphism:AIDS susceptibility in non-human primates［J］．Trends Immunol，2005，26(4):227-233

9 Benichou G，Kant CD，Madsen J，et al．Modulation of alloreactivity to MHC-derived peptides and transplantation tolerance［J］．Front Biosci，2007，12:4239-4247

10 邱趁丽，杨桂波．用PCR-SSP方法检测中国恒河猴Mamu-DRB*W101和 Mamu-DRB*W201基因［J］．动物学研究，2007，28(6):664-669