玉米芯复合酶法制备低聚木糖工艺的研究

汤卫华，殷海松，刘鹏，龙尾

（天津现代职业技术学院生物工程学院，天津300350）

低聚木糖（xylo-oligosaccharide，XO）是水解木聚糖的β-1，4-糖苷键，产物是以木二糖、木三糖和木四糖等组成的木寡糖混合物[1]。低聚木糖甜味纯正，难被人体消化吸收，肠道内残存率高，具有极好的双歧杆菌增殖性，其选择利用性高于其他功能性低聚糖[2]，被广泛应用于食品、饲料、医药等领域。

制备低聚木糖的主要方法包括酸水解法，热水抽提法，酶水解法和微波降解法四种。由于酸水解法要求高、设备投入大、反应产物复杂；热水抽提产物色泽深、精制工艺繁琐；微波降解法仍处于实验室阶段[3]。因此酶法是目前水解木聚糖最常采用的方法。

木聚糖是半纤维素的一种，植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素。在植物细胞壁中，木质素中的阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸类物质以酯键方式与半纤维素支链形成致密网状交联结构，从空间上限制微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，这也是影响木聚糖酶酶解效率的主要因素之一[4]。因此，要提高木聚糖酶酶解效率，首先要破坏半纤维素与木质素、纤维素的交联架构，而单一的酶不可能对所有的糖苷键产生作用，因此要完全降解木聚糖需要几种不同酶的协同作用。本文研究阿魏酸酯酶，木聚糖酶和漆酶复合使用时，可以通过协同作用有效降解致密网状交联结构，促进植物细胞壁半纤维素的酶解产率，提高酶解液中低聚木糖的含量，为后续产品的分离纯化打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米芯：市售；漆酶（1.2×105IU/g）、阿魏酸酯酶（1.5×104IU/g）、木聚糖酶（1.5×104IU/g）：宁夏夏盛集团；其他化学试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F2102 型粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；ZNXMTF-2000 酶解罐：镇江东方生物工程设备技术公司；SHA-BA 恒温振荡器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Delta-320 型酸度计：梅特勒－托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米芯的预处理

选择风干的、无发霉的玉米芯用粉碎机粉碎过80目筛，备用。

1.3.2 复合酶制剂酶解玉米芯制备低聚木糖的正交试验

在单因素实验的基础上进行正交试验，以低聚木糖的得率为考察指标，进一步优化复合酶制剂的配比，正交试验因素水平设计如表1所示。

表1 正交实验因素水平Table1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.3.3 低聚木糖含量及得率的测定[5]

依据3，5-二硝基水杨酸法（DNS 法）测定酶解液中还原糖含量，以还原糖含量代表酶解后的低聚木糖含量。

低聚木糖产率（%）=酶解液还原糖含量（g/L）×酶解液体积（L）/玉米芯干重×100%

1.3.4 复合酶制剂的作用条件对低聚木糖产量的影响

1.3.4.1 反应温度对低聚木糖含量的影响

料液比为1∶20，反应时间为4 h，考察反应温度为30、40、50、60、70 ℃下作用5 h 后，测定低聚木糖的含量。

1.3.4.2 反应时间对低聚木糖含量的影响

料液比为1∶20，反应温度为50 ℃，考察复合酶制剂作用0、2、4、6、8 h 后，测定低聚木糖的含量。

1.3.4.3 料液比对低聚木糖含量的影响

将料液比调至1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40，复合酶制剂反应时间为4 h，反应温度为50 ℃，测定低聚木糖含量。

2 结果与分析

2.1 复合酶制剂的配比对低聚木糖含量的影响

按照1.3.2 正交试验设计进行正交试验，复合酶制剂加入到料液比为1∶20 的玉米芯，于55 ℃下水解6 h，计算低聚木糖的得率，正交结果分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交结果分析Table2 Orthogonal Results

表3 方差分析表Table3 Variance analysis of results

由表2和表3可以看出阿魏酸酯酶（A）、漆酶（B）及木聚糖酶（C）的影响顺序为C>B>A，组合A2B3C2最好，即阿魏酸酯酶0.2%、漆酶0.3%和木聚糖酶0.6%。

2.2 复合酶制剂的酶解条件对低聚木糖得率的影响

按照1.3.5 的条件，考察水解温度、水解时间和料液比对低聚木糖得率的影响，结果如图1（a），1（b），1（c）所示。

图1 复合酶制剂酶解条件对玉米芯中低聚木糖得率的影响，1（a）水解温度；1（b）水解时间；1（c）料液比（g∶mL）Fig.1 Effect of hydrolysis conditions on xylooligosaccaride yield，1（a）hydrolysis temperature；1（b）hydrolysis temperature time；1（c）solid-liquid ratio

图1（a）显示，随着酶解温度的提高，酶解产物低聚木糖得率也提高，当温度提高至50 ℃，低聚木糖得率达到65.2%，进一步提高水解温度，低聚木糖得率不再提高，因此选择复合酶制剂的水解温度选择为50 ℃。图1（b）的结果显示，低聚木糖的得率随着水解时间提高而增加，当水解时间达到4 h 后，再继续水解，低聚木糖得率增加速度缓慢，因此选择复合酶制剂的水解时间为4 h。从图1（c）可知，料液比为1∶20时，低聚木糖的得率达到最高，为68.5 %，因此酶解料液比选择1∶20（g∶mL）。

在水解温度为50 ℃、水解时间为4 h、料液比为1∶20 的条件下，复合酶制剂酶解玉米芯后，低聚木糖的含量达到16.8 mg/mL，比单一酶制剂木聚糖酶的作用提高了64.7%（图2）。

由图2可知，复合酶制剂中漆酶和阿魏酸酯酶起到很好的协同作用，阿魏酸酯酶，又称为肉桂酸酯酶，是一种羧酸酯水解酶，可以水解阿魏酸与半纤维素之间的酯键，从而破坏细胞壁的骨架结构，使原料结构更为疏松[6]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可以破坏玉米芯中半纤维素酯键，有效降解细胞壁中的木质素，削弱木质素对半纤维素木聚糖的屏蔽作用[7-8]。在漆酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，使玉米芯中木聚糖从细胞壁中大量释放出来，木聚糖更容易结合至木聚糖酶的结合位点，促进玉米芯的降解和低聚木糖的产生。

图2 复合酶制剂和单一酶制剂的酶解效果比较Fig.2 Changes of xylooligosaccaride yield on compound enzyme and single enzyme hydrolysis

3 结论

正交试验确定复合酶制剂影响顺序为木聚糖酶>漆酶>阿魏酸酯酶，复合酶制剂中阿魏酸酯酶、漆酶和木聚糖酶添加量分别为0.2%、0.3%和0.6%。复合酶制剂的反应条件分别是水解温度为50℃、水解时间为4 h、料液比为1∶20（g∶mL）。在最适条件下复合酶制剂处理玉米芯原料后，低聚木糖含量达到16.8 mg/mL，比单一酶制剂木聚糖酶提高了64.7%。

[1] Bhat M K.Oligosaccharides as functional food ingredients and their role in improving the nutritional quality of human food and health[R].Recent Res Dev Agric Food Chem,1998,2:787-802

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