重组白喉毒素活性的研究进展

李泽鸿，付玉和，刘 莹，史 飞，刘玉华

(1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118;2.哈尔滨工程大学医院，哈尔滨150021)

白喉毒素(DT)是白喉杆菌产生的细菌外毒素，是一个由535个氨基酸组成的多肽，分子量约为62 kDa［1］。有三个不同功能区:N端为催化区，中间为穿膜区，C端为受体结合区，其中催化区为毒素发生毒性作用的部位，是白喉毒素的酶活性区，它通过阻止延长因子-2在核糖体内促进多肽链延长而抑制蛋白质合成造成细胞死亡，具有极强的细胞毒性。这类毒素的毒性很强，能损害哺乳动物的大多数器官，如心脏、肝脏、肺和肾脏［2］。人类、猴、家兔、豚鼠以及家禽等的组织细胞对白喉毒素均敏感，而小白鼠、大鼠的组织细胞对毒素不敏感。鉴于其对细胞的巨大杀伤作用，近年来白喉毒素被广泛用于肿瘤的基因治疗以及疾病动物模型的建立，白喉毒素就被用在小鼠和人类的抗癌上，而且将它的突变体用于免疫和抗炎，如CRM197虽然没有白喉毒素的活性，但它含有免疫作用［3］。

免疫毒素(immunotoxins，ITs)的概念源于1906年德国药物化学家Erhlich提出的靶向治疗，免疫毒素是由肿瘤特异性的基团(如抗体生长因子或者是肽)与修饰的毒素组成的嵌合蛋白，这些分子与细胞表面受体结合，然后通过内吞作用进入细胞内导致细胞死亡。蛋白质工程和噬菌体展示技术的进步使得更高亲和性的靶向部位的选择成为可能［4］。因此，在构建免疫毒素时，既要寻找具有细胞选择性的定向“载体”，又要筛选高效的毒素“弹头”。近年来也有研究表明不与肿瘤特异性基团结合的重组白喉毒素也对肿瘤细胞具有杀灭作用［5］。由于白喉毒素类免疫毒素能高效、特异地杀伤特定靶细胞，从而使其在肿瘤等疾病的药物开发中暂露头角，1999年美国FDA批准一种基于白喉毒素的免疫毒素ONTAK上市，用于治疗成人皮肤细胞淋巴瘤，因而推动了一批白喉毒素类免疫毒素的开发与临床研究［5］。随后的研究表明其在其他一些肿瘤以及一些自身免疫病、免疫排斥方面等也有作用［6］。

1 重组免疫蛋白或者免疫偶联物的构建

选择性免疫毒素的原则在于肿瘤细胞通常具有极少或特定的生长因子，受体或抗原在细胞表面高度表达，与这些分子一致的配体与修饰毒素结合(通过修饰来减少它本来的功能)［7］，近几年使用被截断的缺乏受体结合域的白喉毒素来构建重组免疫毒素是获得有效毒素的最佳方案之一，这种单链构造物具有低分子量，更容易转移进入组织，低毒性等一系列优点［8］。

1.1 短肽与白喉毒素的重组构建 基于肽的治疗已经成为在癌症靶向治疗的最有前途的治疗策略之一，抗体基础上的免疫偶联物是以能传递细胞毒素到达靶点的单克隆抗体为靶向目标。利用PCR技术构建短肽与白喉毒素的重组原核表达载体，并进行重组蛋白的表达及鉴定，从而为进一步研究导向肽对恶性肿瘤的靶向性治疗奠定了基础［9］。如DT390-triTMTP1能通过选择性地诱导细胞凋亡和抑制癌细胞增殖来控制癌症的病情［10］。细胞毒素剂可以是强效药物、放射性同位素、毒素等，这些分子称为抗体药物，偶联在白喉毒素基础上构建的免疫毒素与抗体结合构建免疫偶联物是癌症治疗的一种可能的途径［11］，如白喉毒素和猪细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CD152)构建的重组融合蛋白，通过构建可溶的N-端糖基化和N-端非糖基化的猪CTLA-4经过小鼠病理实验选择出最具亲和力的免疫蛋白用于移植耐受、自身免疫病和癌症治疗［12］。以及二价的抗人的CD3免疫毒素重组体的分子修饰导致小鼠体内毒副反应减少［13］，双特异的配合基定向毒素(DT2219ARL)靶向作用于人类CD19和CD22感受器导致系统B细胞肿瘤的治疗功效提高［14］。

1.2 与细胞因子重组的功效 与细胞因子的重组构建相匹配，机体的各种细胞均能合成和分泌小分子的多肽类因子，它们调节机体的生理功能，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡并行使功能，这些因子称为细胞因子。根据细胞因子的功能可将其分为干扰素(IFN)集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、DT转化生长因子β(TGF2β)及生长因子等6类［15］，继ONTAK 之后各国科学家对白喉毒素与细胞因子的重组蛋白进行了很多的研究，如DTIL3K116W(白喉毒素与白介素3的融合蛋白)已进行了一期临床研究［16］，以白喉毒素为基础与猪白细胞介素2重组融合蛋白来减少猪的CD25+细胞的研究已证明了其稳定性［17］，靶向作用于白血病细胞系的白细胞介素2受体的经过修饰的IL2融合毒素蛋白的构建，以及在ONTAK基础上构建的4个融合蛋白SPRSV1、SPRSV2、SPRSV3、SPRSV4，然后通过各种细胞系实验检验其对白血病细胞系的毒性大小得出最佳选择［18］，发现DT388-粒细胞集落刺激生物因子融合蛋白用于骨髓白血病［19］，DAB389IL-2抑制中枢神经系统的自身免疫炎症同时抑制T细胞介导的神经胶质靶向细胞［20］，重组细胞免疫毒素蛋白DT390-IP-10在体内控制质粒DNA编码弱化实验性自身免疫［21］等。

2 免疫毒素的纯化和筛选

2.1 白喉毒素的毒性 白喉毒素本身毒性过大，不能直接作为抗原使用，研究发现通过聚合物甲氧基聚乙二醇激活利用共轭亲和层析纯化DT和DT解毒的替代方法，从纯化的毒素所获得的类毒素维持其免疫原性的特点［22］。很多重组的治疗蛋白已经通过大肠杆菌被纯化，因为大肠杆菌中的表达容易获得，同时一些不利因素，如蛋白质聚集，形成内涵体，蛋白被脂多糖污染等均可以适当解决［23］。

2.2 白喉毒素的重组活性区域 用多重蛋白酶缺陷株BH460可表达出一个N端254个氨基酸炭疽致死因子和N端389个氨基酸的白喉毒素DT389和人类细胞转变生长因子α(TGFa)的融合蛋白，这个融合蛋白能够结构性表达，并成功在培养的炭疽杆菌上清液中成功分泌，通过离子交换层析和溶蛋白酶裂解从目标融合蛋白(DT389-TGFa)中除去 LFn［24］。

2.3 重组蛋白的纯化 为了获得有较高生物活性的靶向重组毒素DT389-IL13，在大肠杆菌中高效表达DT389-IL13，并采用凝胶过滤的方法对DT389-IL13进行柱上复性及初步纯化，然后使用离子交换色谱方法进一步纯化［25］。

2.4 重组白喉毒素的筛选 人类基因组计划的开展和组合化学库技术的发展，使用高通量筛选，成为各制药企业和研究机构抢占市场、加快药物研发步伐的首选［26］。定量的高通量筛选测量细胞内吞作用和ab内酰胺酶致死因，为避免致死的炭疽毒素和白喉毒素可利用阻碍炭疽毒素内化的小分子的识别一些小分子保护RAW264.7巨噬细胞和中国仓鼠卵巢细胞［27］。

3 临床应用

3.1 重组白喉毒素的活性实验 重组白喉毒素的动物实验报道多、疗效好、可使荷瘤小鼠完全治愈，副作用低，动物实验表明DT/GM-CSF可抑制裸鼠体内移植性AML细胞的生长［28］。荷瘤裸鼠实验表明，重组毒素的疗效与使用方法有关，隔2 d注射共5次最为有效。在SCID鼠、大鼠、猴上均有效［29］，而且局部应用重组毒素疗效优于全身应用［30］。应用含有白喉毒素A片段(DTA)融合脂质体对肉瘤(S-180)细胞进行体内、体外杀伤实验，结果表明ddy鼠实验组比对照组多存活60 d［31］。对于用裸鼠建立的乳腺癌MCF-7细胞移植瘤模型应用瘤内注射法给予重组质粒PGL3-DF3-DTA治疗，治疗结果表明重组质粒PGL3-DF3-DAT可以明显减少肿瘤体积，抑瘤率为50.08%［32］，DT390-biTMTpl融合蛋白通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞坏死，发挥抑制裸鼠皮下瘤的生长作用［33］。

3.2 白喉毒素的免疫实验 白喉毒素能够和细菌鞭毛蛋白共同刺激IL-17生产胸腺细胞，作为免疫细胞群对微生物组件做出快速反应［28］;白喉毒素介导的免疫应答应用于对胃肠道细菌感染研究的CD11c-DTRtg模型中［19］;能损害哺乳动物的大多数器官，如心脏、肝脏、肺和肾脏。具有生化和生物学特性的交叉反应的材料197(CRM197)与白喉毒素的无毒突变体的偶联蛋白可以作为疫苗或其他潜在的临床应用［34］。

3.3 肿瘤的靶向治疗 肿瘤靶向蛋白是由毒素酶制剂与能与癌症相关抗原结合的细胞特定结合域结合形成的，靶向毒素的抗肿瘤治疗有其天然副作用，靶向治疗应用于人类的前景取决于其副作用的减少，一些植物次级代谢产物(皂苷)被证明能增加表皮生长因子受体为靶向毒素的功效，并且在很大程度上减少副作用［35］。

3.4 白喉毒素对动物的药用研究 以白喉毒素为基础的免疫毒素与很多临床的应用相关，猴、家兔、豚鼠以及家禽等的组织细胞对白喉毒素均敏感，因此白喉毒素作为杀害鼠类的药物具有一定空间［21］。如自身免疫疾病的治疗和器官移植耐受性，已存在的抗白喉毒素抗体，要求在接种抗白喉毒素或者被白喉杆菌感染后，能干涉或者抑制这些抗免疫毒素的功能［5］。

3.5 白喉毒素对动物的细胞研究 以白喉毒素为基础的免疫毒素常用于中枢神经系统胶质瘤、白血病恶性脑瘤、肝癌等［36］，白喉毒素对许多动物的致死率极高，如家兔、豚鼠及灵长类。将这些致死剂量换算到人类大约是0.1 μg/kg 体重［16］，如 DAB389IL-2能通过显著降低脊髓病变细胞内的CD4+，CD8+，CD25+，TCRγδ+表型和 CD11b+巨噬细胞数量［37］，来抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎［38］;389-hIL13-13E13K(白介素13和白喉毒素的融合蛋白)能靶向地杀灭肝癌细胞，为肝癌治疗提供一个新的策略或者一个可供选择的方案［39］。

3.6 重组白喉毒素的临床研究 除了已经被FDA批准的 ONTAK(DAB389-IL-2)外［7］，还有一系列的白喉毒素类免疫毒素已经进入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验阶段:应用于急性髓系白血病的DT388-GM-CSF进入Ⅰ期临床等［40］。如应用于上皮癌的DAB389-TGF-α已进入Ⅲ期临床，应用于骨髓瘤细胞的DAB390-IL-6进入Ⅲ期临床［41］;用于乳腺癌的DAB389-EGF应用于Ⅱ期临床［41］。

由于重组毒素的活性都要通过动物体体现功效，而且实验表明每一种重组毒素都会产生一定的特异性活性，可见重组白喉毒素由于具有高特异性、高细胞毒活性，无疑是动物肿瘤和人类治疗的主要方面。虽然目前上市的重组白喉毒素类只有ONTAK(DAB389-IL2)，应用的经验与知识尚不够丰富，但是针对各种细胞表面特征分子的相关免疫毒素的研究报道层出不穷，一些免疫毒素在临床试验的Ⅰ、Ⅱ期显示了对化疗耐药性和难治愈癌症的明显抗癌活性。

4 小结与展望

由于重组白喉毒素类是通过细胞表面受体内化到靶细胞上的，因此肿瘤细胞表面受体的高度表达是免疫毒素具有较高抗肿瘤活性的关键，应考虑到如何选择最恰当的方法连接靶向部分和毒性部分。连接方法的恰当与否直接关系着白喉类重组免疫毒素的稳定性、靶向能力和毒性效力。可利用不同的导向因子，不同的连接方法连接到白喉毒素，构建不同的重组白喉毒素，达到治疗不同疾病的功效，实现重组毒素特异性强的特点，减少白喉毒素的免疫原性，达到降低或消除其副作用的目的。另外通过调节细胞表面靶点的表达促进白喉毒素类免疫毒素的作用，寻找靶细胞上特异的靶点，包括对决定载体及毒素分子免疫原性的部位进行定位突变或基因删除等修饰，选择小分子量的毒素，开发人源化的载体选择恰当的连接子以提高载体和毒素分子的稳定性。

综上所述，开发亲和力强而细胞内毒副反应弱的融合蛋白是重组白喉毒素构建和临床应用的重要方向。而且重组白喉毒素也可以在治疗动物的免疫疾病和肿瘤尽显功效。尽管白喉毒素类免疫毒素靶向治疗肿瘤尚存在一些问题，但随着蛋白质及基因工程技术的发展，重组白喉毒素类免疫毒素将有望成为治疗恶性肿瘤的有效手段。相信具有高效、特异性强的白喉毒素类药物在癌症治疗的临床应用上将有着更大的发展空间和更广阔的应用前景。

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