大黄素对腹腔严重感染大鼠血浆血小板活化因子和降钙素原及一氧化氮水平的影响

高 举，刘弋

目前，严重感染导致脓毒症以及败血症的发生并最终出现全身炎症反应综合征 (SIRS)合并免疫失控还缺乏切实可行的治疗方法［1-6］。为探讨血浆血小板活化因子 (PAF)、降钙素原 (PCT)等内源性递质以及一氧化氮 (NO)水平在发生炎症反应时的变化，明确其与腹腔感染程度的相关性，通过干预前后水平变化来观察大黄素能否通过降低血浆内毒素水平来改变机体免疫反应以及通过对腹腔严重感染状态下自由基如:NO水平测定观察这类药物是否具有稳定腹腔严重感染状态时体内自由基释放-清除机制及氧化-抗氧化机制。为此，本实验通过制作腹腔严重感染模型，研究大黄素干预前后血浆PAF、PCT、NO水平的变化规律，为临床有针对性地采取有效治疗措施提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康无特定病原体级 (SPF)雄性SD大鼠36只，年龄 (81．0±11．6)d，体质量 (303±43)g(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)。所有大鼠实验前在中科院动物饲养中心适应性饲养1周，且经中科院伦理委员会批准。实验前禁食12 h，自由饮水，按照100 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉。

1．2 实验药物及试剂 大黄素购自美国Sigma公司，纯度＞98%，批号:E8772。四磨汤为湖南汉森制药有限公司生产，购自航空总医院药房，批号:1302118546，10 ml/支。头孢他啶为哈药集团制药总厂生产，购自航空总医院药房，批号为:1301022，0．5 g/支。酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂盒购自北京中昊时代生物科技中心。

1．3 方法

1．3．1 腹腔严重感染模型制备 腹腔严重感染是指合并脓毒症与脓毒症休克的腹腔感染，多发生于消化道穿孔、破裂等继发性腹膜炎［7］。造模采用公认的盲肠结扎穿孔术 (CLP)制作腹腔严重感染模型［8-9］。麻醉满意后，取腹部正中纵行切口，逐层切开进入腹腔，仔细辨别寻找盲肠，游离盲肠系膜过程中需注意避免损伤回盲肠血管，提起盲肠将其放置于腹腔外，保护腹腔防止污染。在盲肠中部约1/2处用0#丝线结扎后用16 G针头在盲肠结扎线与盲肠末端中间行贯通性穿刺，穿刺过程中避免损伤血管。将少量盲肠内容物从两侧针孔轻轻挤出，确保穿孔部位完全开放，制模过程中使每只大鼠挤出内容物的量一致，再将盲肠还纳入腹腔，分层缝合腹壁切口，术毕。术后各组动物均自由进食、饮水。术后每日静脉推注头孢他啶溶液(20 mg/kg)。

1．3．2 实验分组及治疗 将36只大鼠随机分为:空白组、对照组、大黄素组，每组12只。空白组:术后第1天开始0．9%氯化钠溶液 (5 Ml/kg)灌胃，2次/d，连续3 d。对照组:术后第1天开始四磨汤 (5 ml/kg)灌胃，2次/d，连续3 d。大黄素组:术后第1天开始大黄素 (1．5 mg/kg)灌胃，2次/d，连续3 d。

1．4 血标本的采集与检测 腹腔严重感染大鼠治疗前、治疗后72 h从尾静脉抽取静脉血10 ml注入肝素抗凝无菌瓶中，4 000 r/min离心10 min，离心半径84 mm，取上清液送检。PAF、PCT、NO水平检测采用ELISA法，采用Thermo Multiskan MK3公司的全自动酶标仪，以上操作方法均严格按试剂说明书进行。

1．5 统计学方法 采用SPSS 17．0统计软件包进行数据处理，计量资料以 (±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

治疗前，3组大鼠PAF、PCT、NO水平比较，差异均无统计学意义 (P＞0．05)。治疗后，3组大鼠PAF、PCT、NO水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0．05);其中对照组、大黄素组 PAF、PCT、NO水平较空白组降低，大黄素组 PAF、PCT、NO水平较对照组降低，差异均有统计学意义 (P＜0．05，见表 1)。

3 讨论

目前，研究表明PAF、PCT、NO作为炎性指标，广泛运用在腹腔严重感染的诊断和治疗中［10-12］。PCT是一种人类降钙素的前体物质，PCT水平升高的幅度与全身细菌感染程度呈正相关。目前普遍认为PCT较肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等其他检测指标更灵敏、更准确［10，13-14］。本实验中大黄素组与对照组均有治疗效果，治疗后PCT水平下降，但大黄素组较对照组治疗效果更明显。实验结果说明大黄素能够有效控制机体的炎性反应。其作用机制与大黄素降低血中炎性递质水平联合肠道去污降低全身细菌感染程度有关。

PAF是一种内源性脂性递质，具有广泛的生物学特性［15］。多数研究认为PAF在诸多参与胃肠黏膜损害的炎性递质中起到“中心放大”的介导作用，诱导并加速炎性反应的发生、发展，其显著增多可以产生中性粒细胞、活性氧、白三烯等大量炎性递质［16-19］。本实验中腹腔严重感染大鼠PAF水平升高也验证了PAF能够诱导、启发并且扩大靶细胞的炎症，大量炎性细胞因子的产生短时间内激起炎性反应发生，使得免疫自稳态迅速遭到破坏，机体免疫自稳态被打破从而引起免疫的亢进或抑制，进一步导致炎性反应失控，最终引起多器官功能障碍。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一类广泛存在于细胞膜的磷脂水解酶，催化甘油磷脂上二位 (Sn-2)不饱和酰酯键水解，形成一分子溶血卵磷脂和一分子游离脂肪酸，溶血卵磷脂继而转化为PAF［20-21］，大黄素降低PAF水平可能与其具备降低PLA2能力有关。本实验结果显示大黄素组与对照组治疗后PAF水平下降，而大黄素组较对照组治疗效果更明显。

表1 3组大鼠治疗前后PAF、PCT、NO水平比较 (±s)Table 1 Comparison of levels of PAF，PCT and NO among 3 groups of rats before and after treatment

注:PAF=血小板活化因子，PCT=降钙素原，NO=一氧化氮;与空白组比较，*P＜0．05;与对照组比较，△P＜0．05

治疗后空白组 12 2．51 ±0．21 2．48 ±0．25 147 ±15 146 ±15 10．45 ±1．32 9．90 ±1．25组别 只数 PAF(ng/ml)治疗前 治疗后PCT(ng/ml)治疗前 治疗后NO(mmol/L)治疗前对照组 12 2．48 ±0．30 2．26 ±0．25* 150 ±14 132 ±12* 10．82 ±1．56 7．50 ±0．83*大黄素组 12 2．65±0．25 2．15±0．22＊△ 145±15 116±11＊△ 10．32±1．06 6．20±0．75＊△F 值0．112 0．036 0．071 0．012 0．142 0．025 2．34 3．67 2．87 5．11 2．07 4．15 P值

NO是一种内皮依赖性舒血管物质，炎性反应时会急剧增加，促进炎性反应发展，导致机体受损［22］。本实验中造模后NO水平明显升高，NO的过度增加导致低血压和低灌流的发生，并容易与超氧阴离子自由基的反应生成细胞毒性物质造成自由基损伤作用，促进炎症的发展，使得炎症及免疫状态无法自我调控恢复平衡状态［23］。NO在体内由NO合成酶 (NOS)催化底物左旋精氨酸产生。大黄素已经被证明对NOS有较强的抑制作用，NO水平降低可能与大黄素通过抑制NOS的活性减少NO生成相关［24］。经过正确的治疗NO水平会明显降低，使内皮细胞、血小板等靶细胞对内毒素刺激和敏感性降低，使细胞因子及炎性递质造成的损伤易于控制，最终达到促进机体恢复的目的。

本实验进行过程中按实验操作规范进行，模型制作按照通行盲肠结扎穿孔方法进行［25］。抽血及给药方法亦均按照实验规范进行，实验数据为原始数据，实验结果可信，与目前开展的同类研究得出的实验结论基本符合。

严重感染极易引起脓毒症发生，常诱发多器官功能障碍综合征 (MODS)和SIRS的发生。目前，通常的治疗为早期根据经验采用广谱抗生素治疗同时做细菌培养，结果却是效果欠佳，产生耐药性，超级细菌不断涌现［1-4］，这为感染性疾病的治疗带来很大的挑战［26］。目前，国外对SIRS的研究仍然集中于抗体拮抗剂、乌司他丁、血液净化技术、糖皮质激素、免疫营养支持、炎性相关基因多态性等治疗方法。目前还大多限于实验性研究，临床上并没有取得满意的疗效［27］。

大黄素是一种羟基蒽醌类的衍生物，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用。本实验结果表明大黄素可以降低PAF、PCT等炎性递质，改善NO水平，控制炎性反应，清除体内蓄积的毒素，从而达到改善内毒素血症，调节体内失控的免疫反应的目的。提示通过抑制促炎细胞因子的生产从而降低炎性细胞因子和递质来达到控制炎性损伤，逐步恢复脏器功能目的。其机制为推进肌肉收缩，引起肠道水分含量增加和黏液分泌增多导致腹泻发生，从而清除炎性递质以及肠道内积存毒素［23］，更关键的作用在于抑制脂多糖 (LPS)诱导促炎性反应来控制炎性反应的发生、发展，同时清除血液中炎性递质和氧自由基达到恢复脏器功能，减少机体损伤的目的［28-29］。为临床上治疗腹腔严重感染寻找新思路提供了理论依据。

目前，大黄素已被证明具有广泛应用前景，但对于其作用机制还处于探索阶段，今后研究重点在于进一步明确大黄素对炎性递质水平降低的具体机制，尽快开展临床试验，使之能够尽快应用到临床中来。

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