抗菌肽在水产动物饲料中的应用研究进展

于世亮，王裕玉，徐中玉，石 野，车建芳，杨雨虹＊

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030）

抗菌肽，又称抗微生物肽、抗生素肽，是一种具有广谱抗微生物活性的小分子多肽，是生物体先天非特异性防御系统的重要组成部分 （广慧娟等，2012；姜珊等，2011）。抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌、阴性菌有抑制作用，还能抑制或杀灭真菌、霉菌、原虫和部分有包膜病毒等。这类活性多肽具有免疫原性小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广等优点。已有研究表明，在动物日粮中添加抗菌肽能够提高动物的生产性能和饲料利用率、改善动物肠道微生态环境、提高动物的免疫机能与抗病力（单安山等，2012）。此外，在饲料中添加抗菌肽，可以解决大量抗生素的使用导致致病菌产生耐药性的问题。本文就抗菌肽的分类、作用机理及其在动物生产中的应用作一综述。

1 抗菌肽的分类

抗菌肽在自然界分布广泛，种类繁多。目前已经从细菌、真菌、植物、昆虫、两栖类动物、鱼类、鸟类、哺乳类动物和人体中发现并分离2000多种具有抗菌活性的多肽。根据其来源可分为昆虫抗菌肽，如昆虫防御素（Insect defensins）、天蚕素（Cecropins）等；哺乳动物抗菌肽，如 α-防御素、β-防御素和θ-防御素等；水产动物抗菌肽，如贻贝肽（Myticins）、贻贝素（Mytilins）、鱼类铁调素（Hepcidin）等；两栖类抗菌肽，如蛙肽、爪蛙肽等；植物抗菌肽，如硫素 （Thionin）、脂转移蛋白（Lipid transfer proteins）等；微生物抗菌肽，如杆菌肽（Bacitracin）类等；人工抗菌肽，如合成抗菌肽、基因工程抗菌肽等。

根据结构可分为带有α-螺旋结构的线性抗菌肽，如天蚕素、爪蟾抗菌肽；β-折叠、富含半胱氨酸、二硫键的抗菌肽，如植物防御素、昆虫防御素、α和β防御素；具有环形结构的抗菌肽，如subtilosin A；富含甘氨酸、脯氨酸的线性抗菌肽，如holotricinⅡ、formaecins、abaecins。到目前为止，抗菌肽的分类存在较大争议，但普遍认同的分类方法是依据抗菌肽的二级结构进行分类（Smith等，2010）。

2 抗菌肽的结构特点

抗菌肽的相对分子质量较小，是由20～60个氨基酸残基组成的序列高度保守的短肽，其一级结构相似。抗菌肽的氨基酸N端富含赖氨酸和精氨酸等亲水的碱性氨基酸，中间连接部分的结构则易于插入细胞膜，而C端富含甘氨酸或脯氨酸等疏水氨基酸，常被酰胺化（柳江枫等，2012）。大多数抗菌肽的一级结构中的特定位置有一些较保守的氨基酸残基，例如，第2、5、11位氨基酸残基为色氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等，这些保守的氨基酸残基保证了抗菌肽分子的抗菌活性（Boman等，1985）。此外，大多抗菌肽的热稳定性较强，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解（黎观红等，2011；王典等，2010）。

抗菌肽的功能主要决定于其高级结构。在一定条件下，抗菌肽可形成α-螺旋、β-折叠、环状结构和伸展性结构4种二级结构。抗菌肽的高级结构与抗菌活性的关系为其分子改造和设计提供了理论依据，很多研究人员通过氨基酸替换、增强螺旋度、构建杂合肽等多种方式来获得抗菌活性更强，抗菌谱更广的新型抗菌肽。

3 抗菌肽的作用机理

国内外学者对抗菌肽的可能抗菌机制进行了大量研究，目前较为统一的观点是将抗菌肽的抗菌机制总体上概括为膜结构破坏模式和非膜结构破坏模式两种方式。

3.1 膜结构破坏模式 抗菌肽通过与细胞膜作用，使膜蛋白凝聚、失活，形成离子通道，引起膜通透性改变，最后导致细菌死亡。抗菌肽的杀伤作用依赖于多肽和细菌表面初始的引力，随后抗菌肽与细胞质膜相互作用，这一引力很大程度上是带正电荷的多肽和带负电荷的细菌细胞壁之间的静电作用（Huang，2000；Shai等，1999）。 也有研究认为，抗菌肽是通过与细胞膜上存在的特异性受体及其他因子协同作用而导致细菌死亡的，即胞内损伤机理。此模式机制包括三种模型，分别为桶板模型（Barrel-stave model）、环孔模型（Toroidal pore model）和地毯模型（Carpet models）。

桶板模型指抗菌肽通过静电作用吸附到细胞膜表面，多个抗菌肽螺旋在细胞膜表面聚集形成中空的螺旋束结构，其中疏水性氨基酸残基排列在螺旋束的外侧与磷脂双层相互作用，亲水基团排列在螺旋束内侧，桶板模型中抗菌肽形成跨膜孔洞，质膜完整性遭破坏，细胞膜内部分子通过孔洞渗透到胞外，进而实现抑菌作用 （Yang等，2001）。这一模式仅在少数抗菌肽 （如真菌alamethicin）中得到证实。

环形孔模型即跨膜孔模式，指抗菌肽插入到细胞膜内诱导脂质单层不断弯曲，水分子嵌入，在环孔形成过程中，抗菌肽极性基团与脂质极性基团相互作用，脂质在正常片层结构上倾斜，最终连接到细胞膜两侧片层结构，在环孔形成中不断弯曲，最后形成跨膜环孔（Yamaguchi等，2001）。 该模式与桶板模型区别在于：该模型中即使抗菌肽垂直嵌入到质膜双层上，抗菌肽也总是与脂质的头部相互作用。

地毯模型是指抗菌肽依靠静电吸附与细胞膜上阴离子型磷脂头部基团相互作用，然后在质膜表面积累并平行排列，像地毯一样覆盖在质膜表面。当浓度逐渐增大到临界值时，抗菌肽像去污剂一样裂解细胞膜形成胶团状物质。在临界值浓度下，抗菌肽在细胞膜上形成暂时性环孔，抗菌肽通过环孔进入到质膜内部，由于质膜双层结构遭破坏导致了膜不完整性和微胶团物形成，从而达到杀菌的目的。蛾血淋巴中的抗菌肽cecropin A以及富含色氨酸的抗菌肽indolicidin等均是利用此种机制来破坏细胞膜的（单安山等，2012）。

3.2 非膜结构破坏模式 少数抗菌肽，如马蹄蟹体内的抗菌肽Tachyplesins能在不引起细胞膜结构破坏的情况下快速穿膜，抗菌肽需要先通过静电作用与细菌胞膜相互吸引而结合。抗菌肽穿透质膜后在胞内累积，通过与胞内靶位点特异性结合抑制DNA复制、RNA合成、蛋白质合成、细胞分裂、胞内物质代谢以及细胞信号转导等生理过程，从而达到抑制、杀灭细菌的目的（王兴顺等，2012；Hirakura 等，2002）。

此外，抗菌肽还可以通过其他的方式产生抗菌效果，包括抑制细胞的呼吸作用、抑制细胞壁形成、抑制蛋白质或核酸的合成等，某些富含脯氨酸的抗菌肽还可与细菌的热休克蛋白结合而发挥抗菌活性。

4 抗菌肽在水产动物生产中的应用

4.1 提高成活率 抗菌肽作为饲料添加剂对细菌具有明显的抑制作用。Zasloff（2002）对斑节对虾的研究结果显示，饲料中添加抗菌肽Mytilin可以显著提高其成活率及抗白斑病毒感染能力。研究发现，饲料中添加抗菌肽可以显著提高凡纳滨对虾（宋理平等，2010）和南美白对虾（王广军等，2005）的抗病能力。黄沧海等（2009）研究表明，抗菌肽能显著提高罗非鱼幼鱼抑菌作用。Chiou等（2009）研究报道，重组抗菌肽Chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌罗非鱼的炎症发生并能降低其死亡率。姜珊等（2011）对饲喂抗菌肽的罗非鱼进行嗜水气单胞菌的攻毒试验，结果发现，当添加量为5～20 mg/kg时，嗜水气单胞菌攻毒后的死亡率显著降低，证明摄食抗菌肽可以显著提高罗非鱼的抗病能力，可能是由于抗菌肽在鱼体内直接发挥杀菌的作用，也可能与抗菌肽提高了抗氧化酶与溶菌酶的活力有关。但高剂量抗菌肽却未能显著提高罗非鱼的成活率，可能是因为高剂量抗菌肽破坏了肠道菌群平衡，在杀灭肠道有害菌的同时破坏了有益菌的生长环境，也可能与免疫相关酶类的活性降低有关。

4.2 提高生产性能 在饲料中添加抗菌肽，可提高饲料利用率，促进水产动物生长。李晓颖等（2013）用20%、40%、60%富含抗菌肽乳酸菌发酵豆粕替代 （56.0±0.56）g罗非鱼饲料中的鱼粉，结果显示，20%组罗非鱼增重率、饲料系数与对照组差异不显著，但均显著高于40%组和60%组。宋理平等（2010）研究表明，在（0.10±0.01）g 凡纳滨对虾饲料中添加10g/kg重组抗菌肽制剂后，对虾成活率提高8.41%，相对增重率提高27.60%。陈冰等（2010）在（0.86±0.01）g 凡纳滨对虾饲料中添加 0 ～5000 mg/kg家蝇抗菌肽提取物，结果显示，当抗菌肽提取物添加量为2000～3000 mg/kg时，对虾成活率、增重率、特定生长率、饲料效率显著高于对照组。柴仙琦等（2012）报道，饲料中添加300 mg/kg抗菌肽后，凡纳滨对虾的增重率提高8.76%，饲料系数降低12.5%，而400 mg/kg和500 mg/kg组与对照组相比较差异不显著。姜珊等（2011）研究结果显示，饲料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以显著提高罗非鱼的终、末体质量和增重率。由此可见，在饲料中添加适量抗菌肽对水产动物有促生长作用，可能是因为抗菌肽抑制肠道有害微生物，促进肠道微生物菌群平衡，进而产生促生长的作用。但抗菌肽添加过量会导致凡纳滨对虾（柴仙琦等，2012；陈冰等，2010）和罗非鱼（姜珊等，2011）增重率降低，这可能是因为高剂量抗菌肽会抑制肠道中有益菌群的生长，影响动物体的消化吸收。

4.3 改善免疫功能 当动物体受到细菌、真菌和病毒等病原微生物入侵时，抗菌肽作为免疫效应分子来启动、调节宿主免疫防御体系，从而促进免疫功能以消除感染，保护宿主免受病原微生物侵害（周洪波等，2009）。宋理平等（2010）研究了抗菌肽对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响，结果表明，与对照组相比，饲料中添加10 g/kg抗菌肽后，总抗氧化能力显著提高，而对溶菌酶活性和超氧化物歧化酶活性影响均不显著；水浴攻毒后，超氧化物歧化酶活性提高77.40%，总抗氧化能力提高453.16%。柴仙琦等（2012）研究报道，在凡纳滨对虾饲料中添加抗菌肽后，可显著提高血清非特异性免疫功能。陈冰等（2010）研究饲喂不同水平抗菌肽提取物对凡纳滨对虾血细胞数、吞噬率和免疫相关酶活性的影响，结果表明，与对照组相比，添加2000～5000 mg/kg抗菌肽提取物可显著提高对虾血细胞数量；2000～4000 mg/kg组对虾血细胞吞噬率显著提高。添加量为2000～3000 mg/kg时，对虾血清中酚氧化酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶的活性和总抗氧化能力均维持在一个较高的水平，且显著高于对照组，与对照组相比较，3000 mg/kg组溶菌酶的活性提高1.6倍。王一娟等（2011）研究表明，在河蟹饲料中添加0.4%抗菌肽可以显著提高肝脏、肌肉组织中超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力，显著降低血清谷丙转氨酶、球蛋白及肝脏、肌肉、性腺中丙二醛浓度。李晓颖等（2013）的研究指出，对照组和20%组罗非鱼血清中溶菌酶的含量在整个试验过程中均呈上升趋势，而40%组和60%组的含量呈逐渐下降的趋势。姜珊等（2011）研究结果显示，饲料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以显著提高罗非鱼红细胞总数、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性，说明适量地添加抗菌肽可以提高机体抗氧化酶活力。然而，当添加量为50mg/kg时，肝脏的超氧化物歧化酶与血清中溶菌酶活性显著低于对照组，可能是因为抗菌肽添加量过高时，毒性太强，破坏了肝脏的组织结构与血液组分，导致酶活性下降。

4.4 改善产品品质 对蛋鸡 （吕尊周等，2012）、芦花鸡（郭丽君等，2012）、奶牛（徐名能等，2011）的研究指出，日粮中添加抗菌肽制剂能改善动物产品品质，但关于抗菌肽对水产品品质影响的研究还未见报道，有待于进一步的研究。

5 小结

综上所述将抗菌肽添加到水产饲料中，不仅可以提高生产性能、鱼体的免疫力，而且可以提高水产品质量，是一类极具发展前景的新型抗微生物制剂。对于抗菌肽作为饲料添加剂的可行性虽然已经有了一定的进展，但并不深入，还需要更深入和更系统的研究：（1）构建基因工程菌，提高其表达量，改进分离和纯化技术。（2）研究抗菌肽的免疫原性、安全性、药理学、毒理学、药代动力学及其作用机制等。（3）由于易被动物体内的蛋白酶降解，需要在不影响其抗菌活性的基础上，提高其体内稳定性。（4）其对动物细胞有一定的细胞毒性，在保持其结构与活性的同时，降低其细胞毒性。相信随着分子生物学及基因工程技术在抗菌肽研究与开发领域的应用，这些问题将逐步得到解决，抗菌肽将对水产养殖业的可持续发展将起到重要的作用。

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