活性肽的生理功能与制备方法研究进展

索江华， 李凤玲， 郭春燕

（河南牧业经济学院，河南郑州450011；2.晋中职业技术学院，山西榆次 030600）

肽是指两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而成的化合物，生物活性肽简称活性肽，是一类分子质量小于6 000 kD，对动物生长和生理机能有重要调控作用的肽。本文就活性肽的吸收机理、生理功能及其制备方法研究进展作一简述。

1 活性肽的吸收机理

蛋白质是生命的物质基础，它是由一条或多条具有一定氨基酸序列的多肽链构成的大分子。传统观点认为，动物日粮中蛋白质的吸收即蛋白质经过胃肠道消化后变成游离的氨基酸吸收入血，再在各组织合成蛋白质，所以将动物蛋白质的营养看成是氨基酸的营养。因此，一些饲料厂家通过添加合成单一的氨基酸来降低饲料中蛋白质的添加量，以节省成本。后来发现通过添加氨基酸，以理想蛋白质模式配制的低蛋白质日粮给动物饲喂，不能取得最佳生产性能。随着蛋白质技术和理论的发展，其吸收机制也有新的观点。Smyth和Newey（1962）认为二肽可以被完整吸收。Gardner（1982）研究证实，二肽甚至更长肽链可以被完整吸收。二肽与三肽已经被证明吸收的效率比氨基酸高（Nakata等，1995）。目前认为活性肽的吸收需要载体，分别为肽转运载体Ⅰ和肽转运载体Ⅱ，这两种载体都能转运二肽和三肽（Matthews，2000）。转运体系有三类：一是依赖pH的Na+/H+交换转运体系，不消耗ATP（张翠玲，2014）。Takuwa等（1985）发现肽在刷状缘膜处转运时出现了H+浓度梯度。 Garapathy 等（1985）、Matthews（1987）提出肽转运的驱动力是细胞膜两侧的H+梯度。二是依赖H+或Ca2+的主动转运系统，需要消耗ATP。三是谷胱甘肽（GSH）的跨膜转运系统。由于谷胱甘肽在生物膜内具有抗氧化的作用，其转运系统具有特殊的生理意义。肽的吸收与其构型有密切关系，与氨基酸的吸收互不影响，其转运具有耗能低、转运速度快、载体不容易饱和等优点。

2 活性肽的功能

2.1 抵抗外源性微生物入侵的作用 生物体为了抵御体外微生物入侵而产生的一类活性多肽被称作抗菌肽。抗菌肽是一类小分子阳离子短肽的总称。Boman等（1993）通过注射阴沟杆菌及大肠杆菌诱导蚕蛹产生了具有抗菌活性的多肽。到目前为止科学家们已经发现在植物、昆虫、微生物、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物，乃至人类等多种生物体中发现并分离获得了多种抗菌肽（滕勇和滕尚辉，2003）。

2.1.1 抗菌作用 天然生物抗菌肽抗菌谱广，既抑制革兰氏阳性菌，又对革兰氏阴性菌起到很好的 抑 制 作 用 （Brofdenk，2005；Vizioli 和 Salzet，2002），特别是对多重耐药菌具有杀伤作用（刘倚帆等，2010）。目前已经发现的抗真菌肽有cecropins、果蝇抗菌肽、线肽素、贻贝素、蝎血素以及人工改造的各种抗菌肽等（杨阳等，2010）。天蚕素在25～100 mg/L时对镰刀菌属和曲霉菌属的病原菌有杀灭作用（Delucca等，1997）。

抗菌肽抑菌的作用机制主要有：一是破坏细胞膜结构完整性，使其通透性增强，造成胞内物质外溢导致细菌死亡。二是抗菌肽引起细菌形态的改变（Pandey等，2011）。 Lee等（1998）用天蚕素 A和蜂毒素分子的片段合成杂合肽分子，处理真菌孢子原生质体，发现真菌细胞正常形态被破坏。三是作用于胞内靶点的杀菌机制。抗菌肽抑菌作用在胞内主要表现为：（1）干扰细胞壁的合成。人源抗菌肽LL-37攻击单个大肠杆菌的过程中，发现其干扰分裂隔膜处细胞壁的合成来发挥杀菌作用（PNAS，2011）。 （2）影响蛋白质的合成。Yenugu 等（2004）发现抗菌肽处理的大肠杆菌也能抑制其蛋白质的合成。 （3）抑制酶的活性（Brogdenk，2005）。（4）改变细胞质膜。 （5）与 DNA 结合，抑制 DNA、RNA和蛋白质的合成。Nan等（2009）通过对indolicidin的修饰，发现其类似物能透过大肠杆菌质膜，并在胞内积累与DNA分子结合。螺旋抗菌肽和一些富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽进入到大肠杆菌细胞内后，与胸腺嘧啶、尿嘧啶等结合，抑制 DNA、RNA 合成（Boman，1993）。

2.1.2 抗病毒作用 抗菌肽抗病毒机制主要表现在以下几方面：（1）病毒有膜结构与病毒外膜结合抑制病毒的作用。如α-防御素对疱疹病毒的作用；美洲鲎素对HIV病毒的作用（Andreu，1999）。（2）抑制病毒的繁殖。如天蚕素A在亚毒性浓度下通过抑制基因表达来阻遏HIV-1病毒的增殖（赵洁等，2008；Wachinger等，1998）。

2.2 对免疫活性的影响

2.2.1 增强免疫活性 能够增强免疫活性作用的肽被称作免疫活性肽，其主要是起到免疫调节作用，不仅影响机体的免疫系统，也影响免疫反应和免疫细胞之间相互作用，维持机体免疫功能的稳定，提高机体免疫力。免疫活性肽的作用机制有以下几个方面：（1）刺激机体淋巴细胞的增殖。Risso等 （1998）报道，Nisin可诱导CD4和CD8细胞的产生，增强细胞免疫功能和T细胞的辅助功能。（2）调节免疫因子的活性。当受到外源菌入侵时，活性肽可促使肥大细胞脱粒化，释放组胺，使血管舒张，促使释放入血的有关免疫细胞增多，具有潜在的消灭感染细胞的能力。研究发现α-防御素可促使大鼠腹腔肥大细胞脱粒，作为单核细胞的趋化因子，抑制糖皮质激素合成以及促进上皮细胞的有丝分裂 （Oppenheim等，2003）。另外，伤口感染病菌后，可以通过激活纤维蛋白酶原来抑制纤维蛋白凝块溶解 （李波，2014）。对NK细胞具有激活作用，梁再赋（2013）报道地龙肽在体外和体内试验中都有增加巨噬细胞的细胞毒性和NK细胞的杀伤活性，提高巨噬细胞、NK细胞分泌NO、TNF-α的水平，增加巨噬细胞的吞噬功能。

2.2.2 抑制免疫活性 有些肽对免疫具有明显的抑制作用。这一类肽主要应用于治疗自身免疫性疾病和预防抑制排斥反应。如环孢菌素A是十一环肽，已经在器官移植和自身免疫疾病中用作抗炎症和杀真菌的免疫抑制剂（宋长征，1992）。

2.3 抗氧化作用 抗氧化作用主要通过清除重金属离子以及与自由基或者可能成为自由基的过氧化物发生氧化还原反应实现的。天然的抗氧化活性肽有肌肽、谷胱甘肽，另外还有大豆蛋白酶解物等，可以抑制体内血红蛋白、脂氧合酶和体外单线态氧催化的脂肪酸败的作用。如谷胱甘肽，其作用主要有清除自由基，因在其结构中含有-SH，容易被体内代谢的自由基氧化失去氢而转变为其氧化型谷胱甘肽，还原的自由基不再损伤生物膜或者侵害生命大分子物质，从而起到保护生命体的作用。肌肽是主要存在于动物肌肉中的天然二肽，具有抗氧化、增强免疫、调节酶活力的作用，主要是通过直接捕获活性氧成分和自由基、螯合金属离子等实现抗氧化作用（韩立强，2004）。抗氧化肽有抑制食物在冷藏时的氧化酸败，在肉制品加工中具有极好的应用前景，且具有高效、低毒等特点，能作为天然抗氧化剂使用。

2.4 促进营养物质吸收

2.4.1 提高日粮蛋白质在体内的沉积量 氨基酸和小肽的吸收机制不同，Hefarty等（1982）研究了蛋白水解物和氨基酸的吸收差异，研究结果表明相同条件下氨基酸和多肽吸收机制不同，肽的氨基酸残基吸收优于氨基酸。氨基酸以主动转运方式吸收，是逆梯度进行，必须依靠钠离子泵转运系统吸收，需要消耗大量的ATP；而小肽吸收是被动吸收，二者互不干扰，有助于蛋白质在体内的沉积。Pharagyn和 Barley（1987）报道，当精氨酸和赖氨酸以游离形式存在时，两者相互竞争吸收位点，游离的精氨酸有降低肝门静脉对赖氨酸吸收的倾向；而精氨酸以肽形式存在时，赖氨酸对其吸收则无影响。

2.4.2 促进矿物质元素吸收 施用晖等 （1996）研究发现，在蛋鸡日粮中添加小肽类物质，血液中的Fe2+、Zn2+含量显著高于对照组，同时也提高蛋壳强度。目前已经证明酪蛋白磷酸肽，是以磷酸丝氨酸为活性中心的肽。通过磷酸丝氨酸与钙、锌、铁等二价金属离子形成可溶性的螯合物，促进金属离子由小肠肠壁细胞被动扩散，吸收后再释放出来，从而有效地避免了钙在小肠中性和偏碱性环境中被沉淀，促进了钙的吸收（Reeves等，1958），此外，酪蛋白磷酸肽还可作为锰、铜及硒等矿物质元素的载体，是一种良好的金属结合肽。

2.5 抗高血压作用 血管紧张素转换酶（ACE）在血压调节过程起到了重要的作用，抑制ACE活性对降低血压有很好的效果，部分活性肽能起到降低血压的作用，称为血管紧张素转化酶抑制肽（ACEI）（辛志宏和马海乐，2003）。 Yasun （1996）用Calpis发酵剂发酵的酸奶饲喂自发性高血压大鼠（SHR），在4～8 h后，SHR的收缩压降低2.36 MPa以上。随后又对组织中的ACE酶的活性进行了检测，结果主动脉中ACE酶的活性降低最多，并发现SHR的主动脉中有两条三肽（IPP和VPP）起到了降低血压的作用，推测其抗高血压作用可能与主动脉中的ACE降低有关。Ferreira和Rocha（1965）从天然蛇毒中发现抑制ACE肽类。Oshima等（1979）选择了细菌胶原酶降解胶原蛋白获得了有较强抑制血管素转化酶的肽，并测出其分子量（在1 000 D以下）和氨基酸组成。 Maruyama（1987、1982）从牛酪蛋白中也成功地获得了ACEI肽，随着研究的深入，又从玉米蛋白、沙丁鱼、磷虾、大豆蛋白等中发现新的ACEI活性肽（吴建平，1998）。目前降血压肽多数来源于乳制品（吴建平，2012）。

3 生物活性肽的制备方法

3.1 生物提取法 因为生物体内富含一些激素类或酶抑制剂等各种天然活性肽，通过一定的工艺对其进行分离提取，如：从酵母中和小麦胚芽中提取谷胱甘肽。因为天然活性肽的含量低，此法较适合用于初步的探索性研究。

3.2 酶水解法 酶水解法是利用酶在最适pH值、最适温度下进行酶催化的水解反应，根据酶的特异性，使蛋白质水解为不同的肽段，从而得到目标肽。大多数活性肽的生产流程为：原料蛋白→预处理→酶解→分离→精制→成品（杜林和李亚娜，2005）。原料的选择是基础，根据目标肽的氨基酸组成或结构来选择廉价农副产品或者废水废物作为原料，如油厂的饼粕类、酒厂的酒糟等。蛋白酶的选择是关键，要求酶既要切出需要的肽段，又要符合食品安全。酶主要有微生物来源、动物来源及植物来源。微生物来源的酶包括酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶及复合酶；动物性蛋白酶包括胃蛋白酶和胰酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、弹性蛋白酶）；植物蛋白酶有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶。随着酶工程的发展，根据需要的活性肽的结构特点，可用酶工程生产特定的酶类 （Gauthier和 Poulit，2003）。此法因为生产条件温和，易于控制，且氨基酸的营养价值没有被破坏，随着发酵工业的发展，蛋白酶的生产量加大，成本降低。

3.3 微生物发酵法 微生物法是利用有益的菌株，接种在蛋白质中，进行发酵，菌株分泌的蛋白酶可以将蛋白切成需要的活性肽，再进行分离提取得到目标肽。根据酶学特性和对底物蛋白分子的利用不同，把菌株进行不同组合，生产合适的肽段。这种方法的关键是菌株的筛选。

3.4 人工合成活性肽

3.4.1 化学合成法 依据目标肽的氨基酸排列顺序，通过化学方法来合成。根据合成的介质分为液相合成和固相合成。液相合成法是合成小分子肽浓缩多肽片段较好的方法。固相合成法优点是固相载体有利于合成中肽链的固定、环化、去保护和纯化，但成本较高，副反应及残留化合物多，限制了规模化生产。

3.4.2 重组DNA技术 通过重组DNA，合成需要的肽段，一旦建立起重组DNA体系，就能生产大量的活性肽。但研发阶段要求很高，成本昂贵（吴建平，1998）。

4 前景及展望

有关活性肽生理功能的研究越来越广泛，对活性肽的吸收、代谢研究越来越深入，其应用范围也更加广阔。目前我国原料利用率不高，许多产品的下脚料或者废弃物中都有丰富的蛋白质资源，通过其制备活性肽，不但成本低廉，而且大大减少了废弃物排放对环境造成的污染。活性肽易吸收、生物学功能广、抗菌效果好，无残留等特性，加上生产低廉，将会产生深远的社会效益和经济效益。

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