邻苯二甲酸酯类毒理学效应及其机制研究进展

李 蕾，宋乃宁，李海山，艾文超，陈会明

(中国检验检疫科学研究院国家质检总局进口化学品研究所，北京 100123)

邻苯二甲酸酯类(phthalate esters，PAE)又称钛酸酯，是1，2－苯二甲酸的酯类复合物质的统称，主要用途作为增塑剂添加至高分子聚合物中增加材料的柔韧性。PAE主要品种繁多，根据分子量大小分为以下2种:低分子量的邻苯二甲酸二丁酯(di－butyl phthalate，DBP)和邻苯二甲酸丁基苄基(benzyl butyl phthalate，BBP)多用于个人护理产品，如香水、护理液及化妆品［1－2］;而高分子量PAE，例如邻苯二甲酸二乙基己基酯〔di－(2－ethylhexyl)phthalate，DEHP〕、邻苯二甲酸二异壬酯(di－iso－nonyl phthalate，DINP)和邻苯二甲酸二丁酯(di－n－butyl phthalate，DnBP)则通常添加于地板胶、墙漆和医疗器械［3－4］等消费品中，用以增加塑料材料的柔韧性。PAE具有基本相似的化学结构，但各个物质显现独特的物理及化学性质。目前研究者已确定不同化学结构的酯类物质具有特异的毒性，但还未阐明具体的机制。人类主要通过食管、皮肤接触及呼吸道暴露于PAE，低分子量的PAE可通过呼吸和皮肤进入人体，而高分子量物质则主要以食管和呼吸道作为主要暴露途径。大部分PAE在人体内代谢经过2个阶段［5］，首先水解为初级代谢物，即邻苯二甲酸单酯，并在尿苷5'－二磷酸葡糖醛酸基转移酶的催化作用下与葡萄糖醛酸反应生成各自的葡糖醛酸结合物。作为PAE体内生物标志物的邻苯二甲酸单酯生物活性增高，比母体化合物具有更高的毒性［6］。目前的动物毒理研究显示，PAE及其代谢产物涉及的毒性终点包括发育毒性［7－8］、生殖毒性［9－10］、免疫毒性［11－12］和肝毒性［13］，最新报道显示其与乳腺癌［14］以及卵巢癌［15］有密切联系。本文针对PAE物质的暴露途径及其在体内毒理学效应及机制进行综述。

1 暴露途径

1.1 注射暴露

对医疗器械及血袋中迁移的PAE物质研究起始于20世纪70年代［16］，研究证实，医用材料中的DEHP通过与药品的接触使患者暴露，最终暴露浓度与所用药品有关，此类暴露具有特定的群体，长期暴露者包括透析、血友病和糖尿病患者。有研究证实，聚氰乙烯(polyvinyl chloride，PVC)储存袋与药品在24～26℃接触4 h后，利用气相色谱的氢火焰离子化检测器可检测到DEHP，且在12 h浓度达到最高值［17］。

1.2 经口暴露

经口暴露于污染的水源、食物以及食物容器是人体染毒最常见的途径，儿童是此种暴露受害的特殊人群。由于PAE与高分子材料的结合并不紧密，因此，儿童在用嘴接触PVC产品后，体内PAE物质水平显著增高。Babich等［18］根据欧洲、加拿大、日本和美国对于软塑料玩具中DINP的研究报告综述了其对于儿童暴露的危害程度。研究采用新的DINP迁移速率测量方式，综合考虑儿童口部运动活动和儿童年龄因素，最终得出如下结论:42%的检测样品中存在DINP，12～23月龄儿童是最大的暴露群体，平均暴露量为每天0.08 mg·kg－1。

1.3 经皮暴露

邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)与DnBP分别广泛存在于香水与指甲油中，研究者调查了2003年5月到2006年7月纽约市186名孕妇个人护理产品使用情况［19］，检测分析孕妇尿样中存在代谢单酯2－甲基－D－赤藻糖醇－4－磷酸和邻苯二甲酸正丁酯，结果显示，使用香水是DEP暴露的重要来源。

1.4 吸入暴露

PAE物质大量添加于建筑材料及消费品中，是普遍存在的环境污染物。对瑞典斯德哥尔摩家庭环境、托儿所及工作环境的11种有机磷酯类和6种邻苯二甲酸酯类物质浓度检测表明，上述物质存在于所有的取样地点，PAE分布更广泛，且两者浓度相差近10 倍［20］。

2 毒理学效应及其机制

目前，PAE对人类健康的潜在危害研究集中在利用体内及动物实验研究该类物质与人类健康终点可能的联系，及其所可能产生的生理学后果。目前，PAE物质危害机制研究重点是其对核受体家族的影响，及后续因氧化损伤导致的炎症反应，上述影响与个体器官病变及人体肥胖糖尿病等疾病息息相关。

2.1 生殖及发育毒性

PAE具有类雌激素效应，在体内外实验及动物模型中都表现抗雄激素作用，可影响个体内分泌及生殖系统发育，并具有明显的性别差异。动物实验证实，产前及发育早期暴露于PAE的雄性动物生殖道会出现尿道下裂、隐睾症、隐睾和肛门生殖器距离缩短等症状，统称睾丸发育不全综合征。传统理论认为，PAE通过影响间质细胞的睾酮生成，减少胰岛素样因子3表达而引发一系列的症状。

Wu等［21］的实验结果显示，小鼠每天暴露DEHP 500 mg·kg－1后，睾酮与胰岛素样因子3减少是一系列睾丸发育不全综合征症状出现的关键，且甲基化程度和DNA甲基转移酶水平在受孕19 d与出生后3 d显著增加。所以，DNA甲基化可能在睾丸畸形中发挥重要作用。DNA的甲基化状态对染色体的结构维持、X染色体失活、基因印记以及胚胎发育、正常细胞功能的维持，乃至疾病的发生是十分重要的。在胚胎期，基因组范围的DNA甲基化模式异常会导致胚胎致死，而在成体中，异常的甲基化则意味着疾病，特别是肿瘤的发生。但在人类胎儿睾丸细胞体外实验中，暴露于任何剂量的邻苯二甲酸单乙基己基酯〔mono－(2－ethylhexyl)phthalate，MEHP〕其睾酮及黄体生成激素刺激类睾酮水平都无变化，不会引起Sertoli细胞的增殖及凋亡，但减少了抗穆氏管激素mRNA的表达，通过调节生殖细胞的凋亡减少其数量［22］。所以推测PAE在小鼠和人类中利用不同的机制影响雄性生殖系统，其生殖系统毒性具有种属及年龄依赖性，可能由于胎儿和青春期生殖器官比成人要敏感的缘故。

PAE物质的生殖毒性还表现为对睾丸及生精细胞的损害作用，干扰生精细胞与Sertoli细胞间的相互作用。DBP抑制睾丸Sertoli细胞中雄激素结合蛋白和抑制素的mRNA表达量，MEHP则通过抑制Sertoli细胞组织金属蛋白酶抑制物－2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP2)水平，激活生精上皮基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)发挥作用。MEHP可阻止CCAAT增强子与CEBPA蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)的结合，从而抑制 TIMP 2基因表达［23］。

2.2 肝毒性

毒理学中对动物肝过氧化物酶体体积、数量及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator－activated receptor，PPAR)的变化判断外源物的肝毒性，PAE作为过氧化物酶体激活剂(peroxisome proliferator，PP)对PPAR具有激活效应，导致过氧化物酶体体积和数量的增加会导致肝肿大或肝癌，其诱导DNA低甲基化也已确认为产生肝毒性的机制之一。

通常认为啮齿类动物中PP通过影响核受体PPARα改变基因转录从而影响肝细胞发育导致癌症。对F344大鼠进行的为期26周的口服邻苯二甲酸二己酯(dihexyl phthalate，DHP)实验，再一次验证了 PAE对 PPAR的激活作用［24］。给药组F344大鼠肝重量明显减轻，病理学观察显示，肝细胞肥大，且血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和谷氨酰转肽酶水平下降。研究表明，DHP诱导肝癌前期细胞损失，是具有遗传毒性的大鼠肝癌致癌物。但最近研究发现，DEHP在PPARα缺失的小鼠中也增加其肝癌疾病的发生，所以推测PP可能依赖其他的核受体影响转录进程，而并非只依赖PPARα引发多重核受体的转录途径［25］。

在人类和实验动物肿瘤研究中，基因组的低甲基化在肿瘤前期发生中发挥重要作用，DNA的甲基化水平和组蛋白修饰程度已经成为肿瘤早期检测的敏感性指标。Wistar雄大鼠经口暴露于DBP后，可降低肝细胞原癌基因c-myc的甲基化程度［26］，但也证实此变化与DNA复制和DNA甲基转移酶活性无关。

无论通过何种途径作用，PAE物质对大小鼠的肝致癌性已经有很充足的数据支撑，在过去的十几年中，包括亚慢性，亚急性和急性相关的实验都揭示了PAE物质的作用机制［27］_______激活PPARα及调控下游转录因子。最近动物模型及转基因鼠系也作为研究对象加入到机制研究中，动物模型及人类暴露于环境中PAE的研究数据显示，啮齿动物及人体癌的诱导产生是几类肝细胞多重分子信号及通路交叉作用的结果，并且证实PAE的作用靶器官不仅只有肝。国际肿瘤研究机构认为，PAE对人类癌症相关靶器官是肝和睾丸，但暴露于PAE与人类肝癌相关的流行病学调查研究很少。

2.3 免疫毒性

PAE 物质具有免疫佐剂性质［28－29］，其机制研究应包括免疫细胞的基因表达及通过细胞机制调节炎症反应［30］。研究证明，BBP不存在佐剂作用，但是其代谢物苯甲醇可引发明显的免疫抑制［31］。免疫抑制是免疫毒理学研究的主要领域，很多研究致力于阐明化学物和药物引起单方面或多方面免疫应答能力降低的可能性。人角膜内皮细胞系B4G12体外暴露于DBP，BBP和DEHP后，细胞繁殖能力降低，暴露于DBP的B4G12炎症细胞因子白细胞介素1β(IL－1β)，IL－8 和 IL－6 分泌增加，基因表达水平也升高［32］。另外巨噬细胞THP－1细胞暴露于DEHP 200 μmol·L－13 h后，分别利用ELISA和DNA微阵及RT－PCR分析检测基因表达及免疫相关因子、趋化因子的改变情况发现，IL－8，CXCL1，CXCL2， CXCL3， CXCL6， CCL3， MMP3，MMP10，MMP14，集落刺激因子2(colony stimulating factor 2，CSF2)mRNA，肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factorα，NF－α)，IL－1β 和 IL－6 mRNA表达水平都明显升高［33］，某些与中性粒细胞积聚有关的炎症和呼吸系统疾病局部或血清中IL－8水平往往升高，如胃炎、炎症性结肠炎、慢性支气管炎等。不同浓度的DBP对巨噬细胞的吞噬能力均有影响［34］，可显著降低表面清道夫受体CD36的表达，引发免疫抑制。先天性或获得性免疫缺陷与微生物感染密切相关，所以对病原微生物抵抗力的破坏是免疫抑制的一个显著特征，常见的感染部位为呼吸道感染、消化道感染、及中枢神经系统及表皮炎症。免疫抑制与肿瘤的产生也有密切关系，人类随着年龄增长胸腺逐步萎缩，胸腺素水平下降，肿瘤产生率也随之上升。

PAE除与免疫抑制相关外，还可引起超敏反应。一般认为Th2可介导炎症级联反应可最终导致过敏性皮炎及哮喘，而胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)公认为Th2反应的调控因子，在异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)诱导接触性变态反应模型评估TSLP作用的实验中，发现DBP致敏导致TSLP水平升高，FITC半抗原与其他溶剂并无此作用。因此，在FITC诱导的接触性过敏反应模型中，DBP对TSLP水平的上调作用是该模型成功构建的重要因素，并可能同时引发Th2型反应［35］。在小鼠淋巴结细胞中，DEHP 与 DINP 可刺激产生 IL－4［36－37］，在大鼠血细胞中，DEHP可明显增加CD11b的表达，并专司炎症细胞从血管至炎症部位的迁移与附着［38］，PAE还可直接作用于呼吸道上皮细胞引发哮喘。

2.4 肿瘤及致癌性

PAE的基因毒性研究及其相关的毒性数据相当广泛复杂，且有很多的实验模型。其毒性表现包括DNA损伤、染色体相关损伤及影响、增加癌症发生概率和细胞凋亡的逆转，及对核受体及基因表达的影响等。

DEHP对雌雄大小鼠肝癌的作用有充足的数据支持［39－40］，除了肝，还有其对潜在靶器官的致癌毒性的报道。雄性大鼠暴露于DEHP可引发腺泡细胞腺瘤，增加Leydig细胞肿瘤发生率，具有剂量依赖性［41］，雌性大鼠暴露则增加患乳腺癌、卵巢癌与肝毒细胞瘤的风险［42－43］。

引发癌症的机制研究涉及动物实验与人体试验，研究证明，DEHP暴露量低于可引发细胞毒性时，对DNA就已造成损伤。体外实验发现，DEHP 1 ～10 g·L－1和 MEHP 30 g·L－1彗星试验结果均为阳性，但此浓度的物质并未具有细胞毒性［44－45］。DEHP在人体组织中可增加染色体畸变的概率，增加多倍体的产生，改变有丝分裂的速率［46－47］。人体细胞组织实验显示，DEHP可影响细胞凋亡和细胞增殖，增加肿瘤细胞系中肿瘤的活动侵袭及扩散，并激活很多特定的核受体。

通过BBP对乳腺癌肿瘤生成过程的研究，确认BBP通过诱导淋巴增强因子1的过表达诱导肿瘤产生。而在卵巢癌细胞系BG－1中，证实在DBP可导致细胞增殖加快，暴露6 h后可上调细胞周期蛋白D和CDK－4，表明其可损伤内分泌系统，刺激雌激素阳性肿瘤细胞的繁殖［15］。而对于肝肿瘤，许多实验证实与PAE物质的PPARα，β和γ核受体激活物活性有关。DEHP代谢物MEHP可激活小鼠PPARα和PPARγ，但其本身对 PPARβ并无激活活性［48－49］。PPAR核受体在不同种类动物肝中表达有差异，其中大小鼠肝中PPARα表达水平较高，而人类则较低，所以目前还未有研究证实PAE物质对人类肝中PPARα有激活作用。根据目前的研究结果，肝肿瘤与PAE物质的联系只限于大小鼠啮齿动物种属，其与人类肝癌的关系无论是基础研究还是流行病学都还未有明确证据［50－51］。

3 展望

尽管PAE作为商业用途已经广泛使用了超过50年，但其关于人类健康暴露相关的研究还不充分。PAE种类繁多，分子结构存在差异，理化性质更是复杂，其毒理学效应与实验种属、靶器官的敏感性及染毒方式有密切的联系。另外，PAE进入人体后的代谢过程也对研究结果产生一定影响，代谢产生的单酯比母体化合物具有更高的生物活性，其毒理学效应也是研究的重点。以上因素也给研究带来了不小的难度，目前的PAE暴露于健康终点研究中的限制主要集中在以下几点:① 分析方法的准确性、敏感性对结果的影响;② 受试人群数量不足;③PAE物质在体内经过代谢后单酯物质定性定量及毒理学效应研究［52－54］。

根据以上所了解的PAE的研究限制及毒性相关的综合背景，建议今后的研究方向从物质暴露方式开始系统研究。确定不同的暴露方式对人体的危害，物质进入人体后侧重母体化合物水解物与人体健康的联系，包括暴露后所涉及的分子通路研究。具体研究包括高分子链PAE体内生物标志物的筛选，长链水解单酯在体内的作用，其对DNA链的损伤作用，其引发疾病的机制研究，以及相关的流行病学研究。另外因为环境中PAE并非单一存在，研究也应涉及PAE混合物的范畴，且其与其他内分泌干扰物相互协作所产生的影响也在研究范围之内。

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