胰岛β细胞发育相关转录因子研究进展

相 磊，袁记方，黄丽洁

(中国人民解放军总医院医学实验动物中心，北京 100853)

胰腺是人体内唯一同时具有内分泌与外分泌两种分泌功能的器官。胰腺的内分泌功能由Langerhans小岛(即胰岛)中的许多不同类型的内分泌细胞完成，这些内分泌细胞主要包括α细胞、β细胞、δ细胞和PP细胞等。内分泌细胞在胰腺细胞总数中占较小的比例，研究显示在成年大鼠中内分泌细胞约占4%[1]。胰岛β细胞主要具有分泌胰岛素的功能，胰岛素是调节血糖浓度、促进合成代谢、调节细胞分化和生长发育的重要激素，体内胰岛素的绝对或相对不足，将导致糖尿病的发生。糖尿病目前在我国的发病率高达11.6%，已经成为我国的一项严重公共健康问题。胚胎期胰腺的正常发育关系着成年期生物学功能的发挥，因此，对胰岛β细胞发育的研究可以为糖尿病的临床治疗提供基础资料。

1 胰腺β细胞的胚胎发育

胰腺起源于肠管内胚层(gut endoderm)，它是脊椎动物原肠胚形成后三个胚层之一，经过一系列的信号调节和逐级转录因子调节最终发育为成熟的器官。大鼠的胰腺产生最早是在胚胎的E8～E8.5 d，在胚胎的第E13.5 d大部分分泌激素细胞(α、β、δ和PP细胞) 开始出现并组成内分泌胰岛[2]。胰腺β祖细胞的发育成熟需要经过两次的细胞跃迁，首先在Sox9、Sox4、NKx2.2、NKx6.1、GATA4、GATA6、Hlxb9、Pdx1、Ptf1α、Tcf2、Foxa2与HNF6等因子的调控下形成第一代胰腺祖细胞。继而经过Sox9、Sox4、GATA6、Pdx1、Tcf2、Foxa2与HNF6等转录因子的调控形成第二代胰腺祖细胞，第二代胰腺祖细胞在Ngn3、Pdx1、Arx、Pax4、Pax6、NKx2.2和NKx6.1的调控下发育为幼稚型的胰腺β细胞，最后幼稚型胰腺β细胞在Nkx6.1、Pdx1、ISI、MafA、Pbx1、Hlxb9等转录因子的调控下发育为成熟的胰腺β细胞。

2 胰腺β细胞的发育调控

2.1 Pdx1

Pdx1基因(pancreatic-duodenal homeobox 1 gene，Pdx1)中文译名为胰十二指肠同源盒基因-1，是同源盒家族中的一员，Pdx1还有许多其它命名，如胰岛素启动子因子-1(IPF-1)、胰岛/十二指肠同源盒-1(IDF-1)、生长激素抑制激素转录因子-1(STF-1)、胰岛素上游因子-1(IUF-1)和葡萄糖敏感因子。

Pdx1在胚胎发育过程中促进胰腺的早期发育和晚期β细胞分化，在成熟β细胞中，Pdx1具有维持β细胞的形态和正常功能，尤其是维持胰岛素分泌基因的正常运行。它也是胰腺发育必要的转录因子以及β细胞形成和成熟的标志。Pdx1表达于小鼠胚胎E8～E9 d的前肠管上皮，在E9～E10 d胰腺前体与胰腺上皮细胞内均有表达，人类在孕后3～4周Pdx1开始表达，7周有胰岛素的产生，12～13周胰岛生成。在Pdx1基因敲除的小鼠与其单基因突变的人中均表现为胰腺发育不良[3-4]。敲除Pdx1基因的模型胰腺，其向外生长和近十二指肠的分化完全消失，但仍有胰芽内分泌α细胞的分化，而且对胰腺间质不产生影响[5]。在妊娠中期无内分泌细胞出现的时候，Pdx1呈现低水平的表达，但是在妊娠的中后期胰腺β细胞出现时，Pdx1呈现高水平的表达。这也证实了Pdx1在胰腺的形成与β细胞分化方面都起着重要的作用。此外，Pdx1还是胰腺β细胞内调节葡糖糖反应的重要因子，通常情况下低血糖可以抑制 Pdx1基因表达。短期的血糖升高可以一定程度地刺激Pdx1基因表达，但长期的高血糖则使Pdx1基因表达明显受抑。

2.2 Ngn3

神经元素3(neurogen in 3，Ngn3)是NOTCH信号通路下游的一种BHLH转录因子，在CNS和胰腺中都有表达，Ngn3是胰腺内分泌细胞分化的重要调控因子，研究证实胰腺所有内分泌细胞的发育均需要Ngn3的调控。Ngn3缺失的小鼠出生后无胰岛[6]。然而最近在斑马鱼的研究中胰腺与Ngn3缺失的胚胎中Asclb与Neuro1替代了Ngn3的功能，胰腺发育并不表现出缺陷，这提示在脊椎动物中存在其他内分泌细胞分化调节因子[7]。Ngn3最早在小鼠胚胎中表达于E9 d，在E15 d时达到峰值，然而在E17.5 d时Ngn3在胰腺内几乎消失。Ngn3的表达受到Notch信号的抑制，Notch信号能够促进Sox9基因的表达，当Sox9基因表达的时候能够激活胰腺内分泌前体细胞Ngn3基因的表达，然而当Notch信号高水平表达的时候则会激活Sox9的抑制物HES-1D的表达从而终止Sox9基因的表达，进而抑制了Ngn3的表达[8]。Ngn3调控着与胰岛发育相关的3755个基因，其中有317个基因对胰腺内分泌细胞的发育起正向调节作用，175个基因起负向调节作用，757个基因在内分泌细胞发育中是否具有表达还没有确定[9]。

2.3 Pax

2.3.1 Pax4

胰岛β细胞功能密切相关的胰岛特异性转录因子-配对盒4(paired box4,Pax4)属于编码促进胚胎细胞增殖、分化及存活的转录因子家族。这类因子参与细胞内信号传导的高级调控，在胚胎发育过程中对细胞分化、更新、凋亡等都起着十分重要的调控作用。Pax4生理条件下对胰岛β细胞的生存和增殖具有至关重要的作用，同时Pax4基因的多态性与糖尿病的发生相关。

Pax4是早期内分泌祖细胞的标志，他主要指导β/δ系细胞的分化。胚胎发育过程中，Pax4转录最初在E9.5 d的胰腺胚芽中出现，胚胎E13.5～E15.5 d时达到高峰，然后下降至低表达水平。通过基因打靶技术提示，Pax4的缺乏可以导致胰岛β细胞和δ细胞的成熟障碍和胰岛α细胞的大量增加[10]。其中胰岛α细胞的增加一方面由于胚胎时期被Pax4抑制的α细胞特异性转录因子Arx的表达增加。另一方面，Pax4的缺乏可以促使成体β细胞向α细胞和PP细胞转化。Pax4还能提高成熟β的数量，通过抑制Pax6减少α细胞分化从而减少胰高血糖素的分泌。

2.3.2 Pax6

Pax6在脊椎动物的眼、脑和胰腺的发育过程中起着重要的作用。在Pax6b缺失的斑马鱼研究中证实在胰腺内分泌细胞分化过程Pax6b缺失的胚胎中不会发育生成β细胞，δ细胞大量减少，ε细胞呈现明显的增多。对Pax6b功能不全的胚胎适度注射Pax6b吗琳代能够显著提高α细胞的数量与胰高血糖素的水平[11]。在小鼠胚胎的E10 d，Pax6表达于内分泌祖细胞，Pax6能够调控内分泌激素的转录，能够刺激内分泌细胞特别是α细胞的增值。此外Pax6还能够抑制胃饥饿素的分泌。

2.4 Nkx

2.4.1 Nkx6.1与Nkx6.2

同源异性框基因Nkx6.1与Nkx6.2在胰腺β细胞的发育与功能执行中发挥着重要的作用。研究显示Pdx1与Ngn3双阳性前体细胞是内分泌细胞共同的前体细胞群,但缺少Nkx6.1在胚胎发育时期会导致β细胞形成异常,而不影响胰腺中其他细胞的分化与发育[12],该研究提示β细胞分化可能也需要Nkx6.1因子在Pdx1阳性前体细胞中持续表达。Nkx6.1在成熟β细胞表达，以此维持着β细胞的正常功能，与此相比Nkx6.2仅表达于胰高血糖素与淀粉酶阳性细胞内，在胚胎发育的E15.5 dNkx6.2的表达将会终止。在Nkx6.1缺失的突变体小鼠中胚胎发育E13 d后无胰岛素阳性细胞产生，致使β细胞的形成降低了85%[13]。在Nkx6.1与Nkx6.2双基因缺失的小鼠中95%的胰腺β细胞丧失，这充分的证实了Nkx6.1在胰腺β细胞发育中的作用，同时证实在胰腺祖细胞形成β细胞过程中Nkx6.2能够代偿部分Nkx6.1的功能。通过转基因技术在Nkx6.1基因缺失的小鼠中在含有Pdx1启动子而无Ngn3启动子下表达Nkx6.1或Nkx6.2能够有效的修复β细胞的的损失。该项研究也证实了Nkx6.2能够代偿Nkx6.1的功能[14]。

小鼠中研究证实Nkx6在胰腺α细胞与β细胞的分化中扮演着重要的角色。Binot等在斑马鱼中研究证实Nkx6.1与Nkx6.2共表达于胰腺初级内分泌祖细胞内，但是他们表达的层次不同，Nkx6.1主要表达于形成胰岛的腹侧，Nkx6.2主要表达与胰腺β细胞内。在斑马鱼中敲除Nkx6.1或Nkx6.2则表现为α细胞的完全缺失，而对β细胞，δ细胞和ε细胞没有产生影响。Nkx6.1或Nkx6.2全部敲除时则表现为β细胞会呈现剧烈的减少[15]。

Nkx6.1与Nkx6.2在胚胎的E9.5 d表达于所有的上皮细胞。E11-E13天Nkx6.1表达于所有Pdx1阳性细胞，但是Nkx6.2不表达。Nkx6.2在胚胎发育的E15 d表达于腺细胞与部分胰高血糖素素细胞内。Pdx1阳性细胞在Nkx6.1与Nkx6.2调控下才能转化为胰腺β细胞。Nkx6.1是β细胞成熟与增值必不可少的一个调控因子。在α细胞的发育过程中Nkx6.1与Nkx6.2也是必不可少的调控因子。

2.4.2 Nkx2.2

Nkx2.2最先表达于胚胎发育的E9.5 d，至E10.5 d半数胰腺上皮细胞均有Nkx2.2的表达，在以后的发育阶段中Nkx2.2主要表达于除δ细胞的Ngn3阳性细胞内。值得注意的是在Nkx2.2缺失的小鼠中无胰腺β细胞的产生，α细胞减少80%，PP细胞适量减少，δ细胞不能执行正常生理功能[16]。有研究证实Nkx2.2能够结合与激活MafA基因从而对胰腺β细胞的分化与形成起到重要的作用[17]。在斑马鱼研究中证实Nkx2.2能够增强导管细胞的形成。

2.5 ArX

磺胺异二甲嘧啶相关同源异型盒(Arx)基因首先是在小鼠神经系统内发现的。最初在E9.5 d胰腺上皮细胞中表达，Arx的表达限制了胰腺内分泌细胞的类型。如果Ngn3敲除则不会表达Arx，这证实Ngn3是位于Arx上游的基因。Arx在形成α、β、δ与pp细胞正常的比例中起到重要的作用。当Arx基因缺失时，δ细胞数量会明显增高，α细胞明显减少[18]。Arx基因主要是促进α细胞的分化并且抑制β与δ细胞的分化，Arx与Pax蛋白的相互抑制作用，在Arx基因缺失的突变小鼠中无α细胞的分化，α前体细胞倾向于转化为β与δ细胞[19]。与此相反在Pdx1阳性细胞中Arx基因过表达则会使β与δ前体细胞倾向于转化为α与PP细胞。

2.6 MafA与MafB

Maf蛋白属于巨噬细胞激活因子(macrophage-activating factor, Maf)家族，是API家族在胚胎发育和肿瘤生成中发挥不同功能的一种基本的亮氨酸拉链转录因子(bZIP)。

MafA是v-maf原癌基因家族的成员,是唯一特异存在于胰岛β细胞的转录因子。在胚胎形成时期,MafA与MafB共同表达于胰岛素阳性的β细胞,而在成人胰腺中,仅MafA表达于β细胞, 参与调节胰岛素合成、分泌和糖代谢等相关基因的表达。MafA蛋白的分布和其他转录因子有所不同，它是β细胞胰岛素基因活化转录因子，胰腺β细胞的成熟和功能的维持都有赖于MafA蛋白的正常表达。MafA不是β细胞形成所必须的一转录因子，但却是β细胞作为胰岛素调控基因功能的必需因子。MafA在血糖调节胰岛素基因表达的过程中发挥着重要作用,葡萄糖浓度的变化可在多个水平调节MafA的表达水平及功能活性。在糖尿病状态下,MafA 的表达和( 或 )活性减低,抑制了胰岛素的生物合成和分泌。MafA与胰岛素阳性细胞是从MafB与胰岛素阳性祖细胞分化而来的[20]。在第二次细胞跃迁中MafA首先表达于胰岛素阳性细胞内。当β细胞从未成熟状态转化为成熟的细胞后，MafB将终止表达。在MafB基因缺失的突变体中胰岛素阳性细胞与胰高血糖素阳性细胞的发育将会延迟，并且这两种细胞的数量将会减少50%，这些研究证实MafB是调控α、β细胞成熟的一个重要因子。

3 胰岛β细胞发育相关转录因子的应用

近年来，人们利用与胰岛发育相关的转录因子将胰腺干细胞定向分化为β细胞，或将非胰岛素分泌细胞转分化为胰岛素或类胰岛素分泌细胞，这在糖尿病治疗方面表现出了巨大的潜力。

构建含有Pdx1基因的真核表达载体，转染介质Superfect介导重组载体转染骨髓间充质干细胞(MSCs)，能增强大鼠MSCs体外分化为功能性胰岛素分泌细胞的能力，对开展胰岛移植治疗1型糖尿病有重要价值[21]。经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象，并有形状类似胰岛β的细胞团出现[22]。

胰岛的发育是许多转录因子在时空上选择性表达的结果, 通常用一种转录因子并不能将非β细胞很好地诱导分化为成熟的、能够替代β细胞的胰岛素分泌细胞, 因此, 目前的常用方法是将几种关键的转录因子共转染非β细胞, 使其定向分化为成熟的β细胞。如构建含 Pdx1与Nkx6.1双基因的重组腺病毒载体，用该载体分别感染人胎肝间充质干细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)，并联合相应的细胞因子分步诱导，研究显示诱导后的细胞能够持续稳定的表达胰岛素。胰岛β样细胞移植能有效恢复STZ糖尿病小鼠的血糖正常水平,维持小鼠良好的生存状态[23-24]。Pdx1与Ngn3协同作用诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化，证实Pdx1与Ngn3双基因联合在诱导细胞转分化为β样细胞方面具有协同作用, 可启动部分β细胞功能相关的基因表达，具体机制尚不清楚[25]。胰岛素转录关键调控因子Pdx1，神经分化因子1(NeuroD1)和MafA三者能协同作用使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞[26]。Ngn3与Pax4对Pdx1诱导间充质干细胞向胰腺分泌细胞分化具有促进作用[27]。

尽管通过广泛的研究，已经明确了胰腺发育的形态学标志，但是我们只是刚刚才开始了解负责决定胰腺细胞命运的众多调节因子和细胞间信号分子。胰腺β细胞发育的基因转录是一个具有等级或级联反应的过程，每一个阶段都不是单独的基因在起作用，而是很多基因共同作用的结果。了解胰腺细胞的发育机制可以更好地控制其再生，更加准确地诱导胰腺细胞的发育，从而应用于胰腺组织的再生研究以及糖尿病的临床治疗。但要使诱导形成的胰岛素分泌细胞达到临床治疗的要求，还需解决许多的问题。目前，利用转录因子将非β细胞诱导为胰岛素分泌细胞的研究时间较短，其分子机制尚不清楚，诱导形成β细胞的比率低，且不成熟；人为导入这些转录因子，是否会引起细胞的其他癌变；诱导形成的胰岛素分泌细胞是否同样会遭到免疫攻击，这类问题尚无定论。但随着胰岛β细胞发育相关转录因子研究的深入，必将为糖尿病的治疗提供更为广阔前景。

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