非小细胞肺癌驱动基因突变及靶向治疗的研究进展

张丹 综述 黄艳 王红阳 审校

肺癌是癌症死亡的重要原因，发病率高，在我国肺癌发病率呈逐年上升趋势，且年均增长1.63%[1]。美国癌症协会（American Cancer Society）对2014年美国癌症死亡人数、发病率、死亡率和存活率进行预测评估显示：新增肺癌患者占全部肿瘤患者的27%（男）和29%（女）；死亡肺癌患者占全部肿瘤患者的28%（男）和26%（女）[2]。

肺癌的靶向治疗已经成为世界趋势并且提高了反应率（response rate, RR）、延长了总体生存时间（overall survival, OS）和无进展生存时间（progression free survival,PFS），但是靶向药物使用一段时间后机体会产生原发性或获得性耐药，其中一个重要原因就是驱动基因发生突变。2013年中国美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年会上非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）驱动基因突变频率最新数据显示：表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）为10%-35%；鼠类肉瘤病毒癌基因（Kirsten rate sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）为15%-25%；间变型淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）为3%-7%；v-akt鼠胸腺瘤病毒原癌基因1（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1, AKT1）为1%；v-raf鼠类肉瘤病毒癌基因B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BせF）为1%-3%；原癌基因人类表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）为2%-4%：丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase 1, MEK1）为1%；v-ras成神经细胞瘤病毒癌基因（v-ras neuroblastoma viral oncogene homolog, NRAS）为1%；磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位基因（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit gene, PIK3CA）为1%-3%；原癌基因转染重排（rearranged during transfection, RET）为1%-2%；c-ros原癌基因1酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase, ROS1）为1%-2%。因而有必要研究驱动基因突变，为靶向药物治疗的发展奠定基础。

1 上游靶点突变

1.1 EGFR突变 EGFR为跨膜的酪氨酸激酶受体，为ErbB家族（HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4）成员之一。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、转化生长因子α（transforming growth factor-α,TGF-α）、角化细胞内分泌因子（amphiregulin, AREG）等配体与EGFR结合[3]，酪氨酸激酶磷酸化激活信号传导通路RAS/RAF/MEK/MAPK、PI3K/AKT/mTOR、STATs，参与细胞增殖、分化、血管形成、转移，其机制主要为：①逃逸细胞凋亡；②新生血管（肿瘤缺氧微环境）；③抵制抑制生长信号；④侵袭和转移[上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）]；⑤生长信号自我供给；⑥基因组不稳定。⑦无限复制（端粒酶的持续表达）。因此EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）如吉非替尼作用的靶点已成为肿瘤药物治疗的热门靶点。

EGFR突变在此11种驱动基因中突变频率最高，常见于女性、非吸烟、肺腺癌、亚洲患者。并且EGFR在大部分肿瘤中过度表达：NSCLC≥50%、头颈部鳞癌≥90%、食管癌30%-70%[4]，其高表达与不良预后和放疗抵抗密切相关。EGFR突变基因位于外显子18-21，突变包括细胞外的缺失突变和细胞内TK区的体细胞突变。缺失突变主要见于747-750位框架氨基酸，体细胞点突变最常见于L858R[5]，其他突变包括△LRE、G719R、二次突变T790M等。机体获得性耐药第一代EGFR抑制剂主要见于：①T790M、T854A、D761Y、L747S突变；②MET传导通路改变；③ EMT；④其他：PTEN（抑癌基因）丢失和胰岛素样生长因子受体（insulin-like growth factor receptor, IGFR）激活等[6]。第二代EGFR抑制剂为阿法替尼，与第一代相比作用范围更广。LUX-lung3和LUX-lung3临床试验数据表明：第二代抑制剂可用于突变患者，也可作用于对第一代抑制剂（吉非替尼）不敏感的患者。此试验有利于指导临床靶向治疗，给对第一代抑制剂耐药及不敏感的肺癌患者带来又一次机会。2013年中国的胸部肿瘤研究组CTONG公布0806结果，数据表明EGFR野生型患者不可使用EGFR抑制剂。该结果为EGFR抑制剂排除了适应症，有利于指导临床靶向用药。

1.2 HER2突变 HER2属于酪氨酸激酶感受器（receptor tyrosine kinase, RTKs）家族，编码调节细胞增殖的跨膜受体。RTKs包含EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3、和HER4/ERBB4。

HER2位于17号染色体，在一些肿瘤中发现其拷贝数扩增[7]。HER2受体不存在与其相匹配的配体，而与其他受体组成同源二聚体或异源二聚体，优先接受EGFR和HER3。HER2可激活せS/せF/MEK（细胞增殖）传导通路和PI3K/AKT/mTOR（细胞存活）[8]。HER2在NSCLC中突变频率为2%-4%，主要见于不吸烟、女性、腺癌患者；最常见的突变位于外显子20的插入突变，增强了HER2激酶活性和信号转导，导致细胞增殖、侵袭和肿瘤发生，此插入突变不能与HER2扩增同时发生。

针对HER2的靶向药物为曲妥珠单抗，对存在HER2突变的肺癌患者有效。一项回顾性分析存在外显子20 HER2插入突变的65例NSCLC患者的临床病理、治疗方案、患者结局的结果[9]表明：曲妥珠单抗的控制率为93%，无进展生存时间为5.1个月，早期患者的平均生存时间为89.6个月，晚期患者为22.9个月。此研究证明了在肺腺癌中HER2基因突变筛选的重要性和HER2靶向药物的治疗潜力。

2 せS/せF/MEK/MAPK传导通路

2.1 KRAS突变 RAS蛋白是下游生长因子受体信号的中心调节位点，调节细胞增殖、分化。せS基因家族包括KせS、HRAS、NRAS，此三种基因高度同源但功能大相径庭。RAS基因突变与多种肿瘤发病机制相关，在缺乏生长因子信号的条件下也可激活RAS GTP酶，导致细胞持续增殖。15%-25%的NSCLC存在KせS突变，大于90%的突变位于外显子2（密码子12或13）。与EGFR不同，KせS突变常见于吸烟、腺癌患者[10]，20%见于白种人，5%见于黄种人。KRAS突变被认为与第一代TKIs和常规化疗耐药相关。一项III期临床试验TRIBVTE研究将晚期NSCLC患者随机分为试验组和对照组，试验组为常规化疗+埃罗替尼，对照组为常规化疗+安慰剂，将其做为一线治疗[11]。试验结果表明KRAS突变能减少试验组患者的肿瘤进展期和OS（OS HR=2.1;95%CI: 1.1-3.8）。然而一项KせS突变III期试验回顾性分析（BR.21、SATURN以及FLEX）表明：患者受益于埃罗替尼和西妥昔单抗的大小取决于患者的KせS野生型突变[12,13]。Planck等[14]研究表明：EGFR突变及EGFR/KRAS野生型存在不同的基因组改变、不同临床病理特征、不同总生存期。可见通过对肿瘤患者进行准确的基因检测，分析临床病理特征，找到最适人群，可使治疗效果最大化。

2.2 NRAS突变 NRAS的突变频率为1%，主要见于吸烟的肺腺癌患者[15]，主要突变形式为G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H。NRAS突变导致NRAS信号通路被激活。目前尚未研发出针对NRAS的靶向药物，但临床前期试验[15]表明NRAS突变对MEK抑制剂敏感。Haarberg等研究[16]显示：HSP90抑制剂XL888对NせS突变的黑色素瘤敏感，可以抑制体外培养细胞生长，使细胞停留于G2期-M期。但对于NせS突变的NSCLC患者的研究还是冰山一角，其针对NせS突变的靶向药物需要进一步研究。

2.3 BRAF突变 BRAF基因位于染色体7q34编码丝/苏氨酸蛋白激酶。做为RAS/有丝分裂原激活蛋白激酶信号通路的成员，BRAF为KRAS的下游传导通路，直接磷酸化MEK，最后引起ERK磷酸化，使细胞增殖和存活。BRAF突变频率为1%-3%，主要见于重度吸烟的肺腺癌患者[17]。目前BRAF突变类型有V600E、G469A、D594G等40多种形式，在NSCLC患者中V600E突变最常见。与KRAS突变相似，BRAF突变在结直肠癌的突变频率（8%-20%）明显高于NSCLC。

BRAF的靶向药物为BRAF抑制剂，目前已研发出多种BRAF抑制剂，但对NSCLC疗效差。第一代BRAF抑制剂代表为索拉菲尼，为第一个已有临床试验证明的RAF激酶抑制剂。第二代以PLX4032为代表，具有高度选择性，并在V600E突变的黑色素瘤III期临床试验中取得明显疗效。2013年5月食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准Tafinlar（dabrafenib）（BRAF抑制剂）治疗肿瘤表达BせF V600E基因突变黑色素瘤患者，但对肺癌患者效果不明显，研究者正在寻找针对BRAF肺癌治疗的靶向药物。

2.4 MEK1突变 MEK1又名MAP2K1，是丝/苏氨酸蛋白激酶，调节MAP激酶信号通路，参与MAP信号传导并参与多个细胞过程如细胞增殖、细胞分化、转录调节。MEK1突变频率为1%，主要见于肺腺癌，最常见的突变为C121S、Q56P、K57N、D67N。SEQ ID NO:2[18]表明C121S突变产生野生型的MEK1蛋白，并对RAF和MEK抑制剂耐药。Q56P突变发生在MEK1激酶区外，此突变可增强MEK1激酶活性，并可与野生型EGFR和ALK同时存在。K57N和D67N突变同样在MEK1激酶区外，导致MAPK信号通路开放，但K57N对小分子的非ATP竞争抑制剂（AZD6244）敏感[19]。MEK1突变促进了第二代MEK抑制剂的研究，第二代MEK抑制剂可用于MEK1突变的患者，疗效值得期待。

3 PI3K/AKT/mTOR传导通路

3.1 PIK3CA突变 PI3K-AKT-mTOR通路首次发现于1990s，为EGFR下游靶点，与细胞存活和抗凋亡相关。PI3K是脂质激酶家族成员之一，参与细胞生长、增殖、分化、运动，其结构为异源二聚体。PI3K包含2个亚基，1个为85 kDa的调节亚基，另1个为110 kDa的催化亚基。PIK3CA基因编码催化亚基p110α。PI3K使细胞内膜的PI(4,5)P2（磷脂酰肌醇4,5-二磷酸）转变为PI(3,4,5)P3[磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸肌醇]。PI(3,4,5)P3招募下游信号蛋白如AKT到细胞膜导致其他蛋白活性增强。PIK3CA突变频率为1%-3%，突变的肺鳞癌患者多于肺腺癌患者，与吸烟史无关，突变多位于外显子9和外显子12，常见于E542K、E545K、E545Q、H1047L、H1047R。PIK3CA突变与EGFR突变可同时出现，并且可在获得性耐药EGFR TKI患者中出现。Bendell等[20]认为PI3K抑制剂可应用于体内实体肿瘤如早期直结肠癌、乳腺癌、肺癌，表现一定的抗癌活性。PI3K抑制剂（GDC-0941、XL-147、PX-866、BKM 120）已在体外证明有效，并在临床试验证明中[21]。

3.2 AKT1突变 AKT是PI3K下游的关键信号，可激活肿瘤发生；AKT又名蛋白激酶B，是调节PI3K信号传导的丝-苏氨酸激酶，由AKT1、AKT2、AKT3组成[22]。AKT1突变编码的蛋白酶B已在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌中发现。AKT1突变率为1%，主要见于鳞癌患者，其突变频率最高的为Glu17Lys，此突变发生于AKT1基因的PH结构域并改变磷酸肌醇结合袋，使蛋白激酶B具有独立于PI3K的活性。

AKT1的靶向药物为AKT抑制剂。ATP竞争AKT抑制剂已被报道有更高的脱靶效应，因此变构的AKT抑制剂已被研发，目的在于研发出特异性抑制剂。例如AKT变构抑制剂结合AKT区的PH结构域，阻止AKT定位到细胞膜并随后被激活。MK-2206为AKT变构抑制剂，磷酸化AKT的308位苏氨酸和473位丝氨酸残基，在体内外均有抗肿瘤活性，从而促进了临床试验的进展。

4 融合基因

4.1 ALK融合 棘皮类微管相关样蛋白-4（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4, EML4）的基因在内含子13断裂与位于内含子19的ALK基因偶联形成EML4-ALK融合基因，此融合基因共包含3,926个碱基对，编码1,059个氨基酸[23]。EML4-ALK融合异常激活下游的信号传导通路如MAPK、PI3K、信号转换器、STAT导致细胞增殖、侵袭，抑制细胞凋亡[21]。ALK融合常见于年轻、男性、非吸烟或少量吸烟的腺癌患者，临床特点为转移早，常见于心包转移、胸膜转移、胸腔内外淋巴结转移、肝转移等。针对该靶点的药物为克唑替尼，属于3-苄氧-2氨基吡啶类抑制剂，与ALK酶的ATP结合位点相结合。克唑替尼已经获得FDA批准可用于ALK+的NSCLC患者，此次批准的根据来源于I期临床试验[24]的数据，该试验表明：使用克唑替尼的总有效率为57%，PFS为6个月的概率为72%。但是一部分ALK+患者存在原发性耐药，一部分使用克唑替尼9个月的ALK+患者也可发展为继发性耐药。Doebele等[25]研究11例ALK+的NSCLC患者克唑替尼耐药的分子机制，研究表明：4例（36%）患者在ALK的酪氨酸激酶区发生二次突变，其中2例患者出现G1269A；1例患者存在耐药突变表现为ALK融合拷贝数增加（copy number gain, CNG）；1例患者存在EGFR突变，ALK融合消失；2例患者显示KRAS突变，其中1例患者不存在ALK融合；1例患者ALK融合消失但未发现其他可识别驱动基因改变；2例患者ALK+耐药机制不明。可知ALK+的NSCLC患者克唑替尼耐药的分子机制复杂，需加大样本量进一步研究。

30%使用克唑替尼的患者早期出现脑转移，原因在于克唑替尼不能通过血脑屏障，其在脑脊液中的药物浓度是外周血的0.002,6倍。目前针对ALK的第二代TKI处于研究临床试验阶段，第二代TKI对ALK野生型突变和对克唑替尼耐药的二次突变有更强的亲和力，能改善药物代谢并能进入血脑屏障，而且对于其他的酪氨酸激酶的靶点如ROS、Met同样有抑制作用。针对ALK的第二代TKI代表之一为LDK378，2013年3月美国FDA认定LDK378是对于ALK+NSCLC的进展期和对克唑替尼耐药的患者是突破性疗法，目前正处于III期临床试验，预期在2014年出台管理文件[26]。

4.2 RET融合突变 RET原癌基因于1985年因激活NIH-3T3细胞DNA重排而首次发现，位于10q11.2 外显子12，在细胞内、外及跨膜区编码酪氨酸激酶。RET融合突变在NSCLC患者中突变频率为1%-2%。RET在正常条件下表达很低，但在RET融合条件下表达明显增高，且RET突变与NSCLC其它驱动基因突变相排斥不能同时发生。Wang等[27]研究具有RET融合突变的NSCLC患者的临床特点，结果显示：RET融合突变常见于年轻人（≤60岁）、不吸烟、早期淋巴结转移、低分化的实体亚型。目前尚没有针对RET靶点的RET抑制剂用于RET融合突变的NSCLC临床试验，但抗RET的酪氨酸激酶抑制剂（靶点不是RET融合基因）已经在NSCLC患者中进行评估。目前正处于试验阶段的vandetanib、sunitinib及sorafenib并不是特殊的RET抑制剂，而是多重激酶抑制剂[28]，其试验结果值得期待。

4.3 ROS1融合突变 ROS1为酪氨酸激酶，属于胰岛素受体家族，位于6q16-6q22，激活ROS1可开通信号传导通路STAT3、PI3K/AKT、せS/MAPK/MEK。ROS1在NSCLC患者中突变频率为1%-2%，其临床特征与ALK易位相似，主要见于不吸烟或轻度吸烟（＜10包/年）、年轻的肺腺癌患者。ROS1融合突变不可与其他驱动基因突变同时出现。ROS1与ALK高度同源，在ATP结合区存在77%的相同序列。使用ALK激酶抑制剂在细胞系和组织中可检测到ROS1融合蛋白，ALK抑制剂TAE664对细胞系HCC78敏感，此细胞系在使用TAE664刺激后可存在SLC34A2-ROS1融合基因，并可在BaF3细胞中表达FIG-ROS融合蛋白。2012年欧洲临床肿瘤协会年会（European Society for Medical Oncology,ESMO）和美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）会议显示对ROS1重排的NSCLC使用克唑替尼2个月后的反应率为57%，疾病控制率为80%[29]。目前AP26113（NCT01449461）和ASP3026（NCT01284192）两个临床试验正在进行中，主要目的为评估ROS1融合突变的患者使用第二代ALK抑制剂的安全性及药物效果，其试验结果值得期待。

5 总结

近年来EGFR及其他驱动基因的发现给肿瘤治疗带来一场改革，使肿瘤治疗不再“一刀切”，通过对患者驱动基因准确检测可实行特异性和规范化治疗。基因检测的普及可使肿瘤治疗真正进入个体化时代。

驱动基因突变与NSCLC患者的病理类型、年龄、性别、TNM分期、远处转移、吸烟史等相关。国际上关于驱动基因突变研究的研究对象大部分为白种人及黑种人，黄种人所占比例偏少，因此在国内进行驱动基因突变的研究是十分有意义的。患者在使用靶向药物治疗过程中发生原发性或获得性耐药，根据不同耐药机制解决耐药问题，将成为我们日后的关注点。

对NSCLC驱动基因进行深入研究可为靶向治疗提供理论依据，有望阐明NSCLC发生的分子机制并找到靶向治疗的最适人群，使治疗效果最大化。驱动基因突变在NSCLC中的意义越来越受到学者的关注，靶向药物治疗已成为趋势。尽管许多基因突变已被发现且靶向治疗存在种种优势，但肿瘤的靶向治疗还存在很多不足，需要我们进一步的研究。