间质干细胞荷载溶瘤腺病毒治疗肿瘤进展

杨春华 毛立军

多数溶瘤腺病毒直接瘤内注射具有良好效果，全身静脉应用后机体免疫系统明显影响疗效［1］，细胞作为载体介导基因治疗可逃避机体免疫从而克服这一瓶颈［2-3］，本文主要对间质干细胞荷载溶瘤腺病毒治疗肿瘤这一研究领域研究进展综述。

1 间质干细胞与肿瘤

宿主免疫可在病毒到达肿瘤之前消除循环中裸露的病毒。探索有效的病毒载体系统逃避机体的免疫并从而改善治疗功效逐渐被广泛关注。自身免疫系统对自身细胞无免疫力，因此将溶瘤病毒隐匿在自身细胞里可克服这一瓶颈，提供一种解决系统性运输溶瘤病毒的方法。理想的载体细胞应该能够对肿瘤有靶向性。越来越多的证据显示干细胞、祖细胞、免疫细胞以及癌细胞［4］具有这一特点，多能干细胞更加明显［5］，如间质干细胞和神经干细胞，目前通过干细胞荷载病毒的传递正在成为一个广泛使用的癌症试验性治疗手段［6-7］。在转移性乳腺癌、卵巢癌和恶性胶质瘤的小鼠模型中已证实间质干细胞荷载溶瘤腺病毒的可行性［8-11］。Dreier等［12］证明荷载干扰素-β（interferon-β，INF-β）人类间质干细胞在转移性黑色素瘤小鼠肺模型中可抑制肿瘤生长并改善动物生存的效果，且来源于骨髓、脂肪或者脐带等不同组织的间质干细胞均被证实具有自然肿瘤靶向性，间质干细胞对肿瘤的归巢能力可能是由细胞因子和趋化因子介导，这种推论的证据来源于间质干细胞存在这些趋性介质的受体。进一步研究发现肿瘤组织生长的微环境中高浓度的细胞因子如成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板源性生长因子［4］、血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、单核细胞趋化蛋白-l等有利于MSCs迁移到瘤床或其周围。经过间充质干细胞复制后释放出来病毒可在肿瘤细胞中复制，对肿瘤细胞产生明显细胞病变效应，并产生的一定诱导凋亡作用，且其凋亡率显著高于直接用相同初始病毒剂量产生的杀伤作用。间充质干细胞具有显著归巢于肿瘤组织的能力，24 h后主要分布于肿瘤组织边缘，72 h后主要分布于肿瘤实体内部。携带溶瘤病毒后的间充质干细胞仍具归巢能力，24 h间充质干细胞主要分布于血流丰富的器官如肝、脾、肺。24 h后，肝、脾、肺组织中的间充质干细胞逐渐减少，而肿瘤组织中间充质干细胞数量明显增多。

2 优化溶瘤腺病毒转导间质干细胞效率

腺病毒血清5型（adenovirus serotype 5，Ad5）是使用最广泛的一种有复制能力的腺病毒［12-13］。腺病毒血清型的纤维蛋白连接到柯萨奇病毒-腺病毒细胞受体的表面，在感染方面是第一个重要的步骤［14］。大多数潜在的细胞载体和恶性肿瘤细胞均低水平表达柯萨奇病毒-腺病毒受体。为克服这一限制，化学和基因修饰的腺病毒已经被广泛研究。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化学修饰是为避免病毒与中和抗体的结合，同时可减少病毒数量以限制病毒引起宿主的炎症反应［15］。将肽或配体连接于PEG链的末端可使腺病毒转染具有组织靶向性。肿瘤和肿瘤相关的血管内皮细胞表面过度表达αv整合素，而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg Gly Asp，RGD）可特异性连接到整合素，利用RGD修饰聚乙二醇化的腺病毒可结合到内皮细胞和肿瘤细胞的αvβ3整合素蛋白［16］。此外，上皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）也已被证明，可以介导腺病毒转染到EGF阳性细胞［17］。这种多肽与PEG化的腺病毒结合模式可传递不同种类病毒到相应受体表达的载体细胞，实现靶向性。细胞与病毒粒子之间的电荷影响病毒基因转移效率，通过中和细胞表面的唾液酸与病毒粒子之间的电荷排斥可以提高腺病毒感染细胞的效率。凝聚胺一种多聚阳离子，可提高体外逆转录病毒和慢病毒介导的基因转导效率。这一策略也被用于腺病毒介导的基因转移，证明能显著提高病毒进入间质干细胞效率且未影响间质干细胞的生存能力。这个简单的方法可以实现高效的基因传导和病毒的生殖并不需进行复杂的遗传修饰。

虽然化学修饰增加病毒传导效率并前景乐观，但是大规模生产却是一种临床挑战。故通过Ad衣壳的基因修饰重新定位肿瘤的策略已被广泛研究。AD5-delta24RGD是可以靶向整合素αvβ3的溶瘤腺病毒［18］，可高效转染柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）低表达的间质干细胞，静脉给予荷载Ad-RGD的间质干细胞可高效转染干细胞，且能够转运和释放病毒颗粒到大脑原位胶质瘤并最终导致提高荷瘤小鼠的存活率［19］。通过7个赖氨酸残基［K7（KKKKKKK）肽］修饰腺病毒纤维蛋白HI环获得（Ad-p7k）可以靶向硫酸乙酰肝素。Ad-p7k有良好的转染效率，并提高数种荷瘤鼠的治疗效果，在间质干细胞的转染效率提高是Ad5的400多倍，Ad-RGD的16倍［20-21］。

超过100个不同的腺病毒（Ads)分为6个亚型（A至F）。其中B亚型的腺病毒可以利用广泛表达在细胞表面的CD46和其他未经确认的蛋白作为受体进入宿主细胞。为实现在广泛细胞类型的转染，增加C亚型腺病毒载体的转导速率。通过基因工程用B亚型的腺病毒纤维球结构域取代C亚型的腺病毒纤维球结构域，这种嵌合体除提高了转染效率，还可以减少肝脏的嗜性，减轻肝脏的毒性，与未修饰的Ad5相比，增加循环时间。因此，嵌合的Ad5载体一定程度克服了未经修饰的Ad5的感染载体细胞的限制。嵌合溶瘤腺病毒Ad5/3与Ad-RGD和Ad5比较对于卵巢癌和乳腺癌裂解能力明显提高。静脉注射荷载Ad5/3的间质干细胞后能明显改善转移性肿瘤小鼠的存活率［22］。表达相对较低水平CD46的间质干细胞，发现可以转染Ad5F35，这也表明在Ad5F35转染过程中，其他未知的受体也参与其中［23］。另外，与Ad5-RGD和Ad5/3相比，Ad5F35也展现出对恶性胶质瘤特异的基因传导和溶瘤作用，可见使用嵌合病毒作为载体细胞介导的肿瘤治疗具有可行性。

Hamada等［24］评价利用卵巢癌起源的细胞载体荷载由IAI.3B启动子调控的溶瘤腺病毒的治疗效果，结果肿瘤细胞荷载溶瘤腺病毒对卵巢癌有治疗效果。另外，利用正常的细胞载体MSC荷载CXC趋化因子受体4启动子（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）调控的Ad可以靶向胸腺癌和恶性胶质瘤。CXCR4启动子调控的Ad在人间质干细胞和胶质细胞中的复制高出野生型E1A基因启动子多倍。在转移性乳腺癌的小鼠模型中，与单独静脉注射Ad相比，人间质干细胞介导的Ad-CXCR4经静脉注射后能显著提高小鼠的存活率［25］。

3 展望

间充质干细胞有跨时代的意义但仍有许多问题需要解决：1）免疫抑制作用持续时间长短、作用强弱，是否会增加机体感染概率、提高机体内细胞恶性病变的可能性还不明确；2）自身致瘤性问题，目前存在较大争议；3）由间充质干细胞诱导分化而来的细胞具有这些组织细胞的形态和表型，但具有这些组织细胞功能的研究还需要大量的研究证实。静脉注射间质干细胞对大多数肿瘤有效，但缺乏充足证据，这种传递方式仍受到质疑。如在脑肿瘤模型中，通过尾静脉注射间质干细胞缺乏对颅内肿瘤的靶向性。为提高肿瘤靶向性，通过小鼠颈动脉注射荷载绿色荧光蛋白标记的腺病毒间质干细胞可进入人脑胶质瘤的局部，获得明显效果。可见通过靶器官的动脉应用间质干细胞可克服间质干细胞的归巢特点非特定性。综上所述，载体细胞归巢和生物产品运行的特点及载体细胞可能对肿瘤生物学的影响需要进一步研究。细胞载体荷载溶瘤腺病毒和基因的模式仍需要从病毒的设计到载体细胞的制备、细胞和病毒的生命周期动力学到药物代谢动力学多种类型专业知识的整合，未来需要所有研究领域的努力，才可能导致这项技术的临床应用。

1 Choi JW,Lee JS,Kim SW,et al.Evolution of oncolytic adenovirus for cancer treatment[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(8):720-729.

2 Yong RL,Shinojima N,Fueyo J,et al.Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells for intravascular delivery of oncolytic adenovirus Delta24-RGD to human gliomas[J].Cancer Res,2009,69(23):8932-8940.

3 Qiao J,Kottke T,Willmon C,et al.Purging metastases in lymphoid organs using a combination of antigen-nonspecific adoptive T cell therapy,oncolytic virotherapy and immunotherapy[J].Nat Med,2008,14(1):37-44.

4 Lee DH,Ahn Y,Kim SU,et al.Targeting rat brain stem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(15):4925-4934.

5 Shah K.Mesenchymal stem cells engineered for cancer therapy[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(8):739-748.

6 Gjorgieva D,Zaidman N,Bosnakovski D.Mesenchymal stem cells for anti-cancer drug delivery[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2013,8(3):310-318.

7 Josiah DT,Zhu D,Dreher F,et al.Adipose-derived stem cells as the rapeutic delivery vehicles of an oncolytic virus for glioblastoma[J].Mol Ther,2010,18(2):377-385.

8 Tobias AL,Thaci B,Auffinger B,et al.The timing of neural stem cell-based virotherapy is critical for optimal therapeutic efficacy when applied with radiation and chemotherapy for the treatment of glioblastoma[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(9):655-666.

9 Ong HT,Federspiel MJ,Guo CM,et al.Systemically delivered measles virus-infected mesenchymal stem cells can evade host immunity to inhibit liver cancer growth[J].J Hepatol,2013,59(5):999-1006.

10 Huang YF,Chen MJ,Wu MH,et al.The use of hypoxic cultured mesenchymal stem cell for oncolytic virus therapy[J].Cancer Gene Ther,2013,20(5):308-316.

11 White KM,Alba R,Parker AL,et al.Assessment of a novel,capsid-modified adenovirus with an improved vascular gene transfer profile[J].J Cardiothorac Surg,2013,8(1):183.

12 Dreier B,Honegger A,Hess C,et al.Development of a generic adenovirus delivery system based on structure-guided design of bispecific trimeric DARPin adapters[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(10):E869-877.

13 Ballard EN,Trinh VT,Hogg RT,et al.Peptide targeting of adenoviral vectors to augment tumor gene transfer[J].Cancer Gene Ther,2012,19(7):476-488.

14 Harrington KJ.Oncolytic virotherapy needs trials,not access programs[J].Clin Cancer Res,2013,19(10):2595-2597.

15 Kim PH,Sohn JH,Choi JW,et al.Active targeting and safety profile of PEG-modified adenovirus conjugated with herceptin[J].Biomaterials,2011,32(9):2314-2326.

16 Gamble LJ,Ugai H,Wang M,et al.Therapeutic efficacy of an oncolytic adenovirus containing RGD ligand in minor capsid protein IX and Fiber,Δ24DoubleRGD,in an ovarian cancer model[J].J Mol Biochem,2012,15(1):26-39.

17 Park JW,Mok H,Park TG.Epidermal growth factor(EGF)receptor targeted delivery of PEGylated adenovirus[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,366(13):769-774.

18 Graat HC,van Beusechem VW,Schagen FH,et al.Intravenous administration of the conditionally replicative adenovirus Ad5-Delta24RGD induces regression of osteosarcoma lung metastases[J].Mol Cancer,2008,7:9.

19 Lamfers M,Idema S,van Milligen F,et al.Homingpropertiesofadipose-derived stemcellstointracerebralglioma and the effects of adenovirus infection[J].Cancer Lett,2009,274(1):78-87.

20 Ranki T,Kanerva A,Ristimaki A,et al.A heparan sulfate-targeted conditionally replicative adenovirus,Ad5.pk7-Delta24,for the treatment of advanced breast cancer[J].Gene Ther,2007,14(1):58-67.

21 Zheng S,Ulasov IV,Han Y,et al.Fiber-knob modif i cations enhance adenoviral tropismand gene transfer inmalignant glioma[J].J Gene Med,2007,9(3):151-160.

22 Komarova S,Kawakami Y,Stoff-Khalili MA,et al.Mesenchymal progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses[J].Mol Cancer Ther,2006,5(2):755-766.

23 Knaan-Shanzer S,van de Watering MJ,van der Velde I,et al.Endowing human adenovirus serotype 5 vectors with f i ber domains of species B greatly enhances gene transfer into human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2005,23(10):1598-1607.

24 Hamada K,Desaki J,Nakagawa K,et al.Carrier cell-mediated delivery of areplication-competent adenovirus for cancer gene therapy[J].Mol Ther,2007,15(6):1121-1128.

25 Sonabend AM,Ulasov IV,Tyler MA,et al.Mesenchymal stem cells effectively deliver an oncolytic adenovirus to intracranial glioma[J].Stem Cells,2008,26(3):831-841.