肺癌患者外周血淋巴细胞亚群与预后的关系*

魏熙胤 张翠翠 臧凤琳 李 凯

肺癌患者外周血淋巴细胞亚群与预后的关系*

魏熙胤 张翠翠 臧凤琳 李 凯

目的：探讨肺癌患者外周血T细胞亚群及NK细胞与临床病理特征及预后的关系。方法：回顾性观察102例肺癌患者、12例肺良性疾病患者及23例健康体检者，记录其外周血T细胞亚群及NK细胞占外周血淋巴细胞的百分比，对比二者分布在肺癌、肺良性疾病及健康体检者之间的差异，并对患者的临床病理资料进行回顾性分析，分析淋巴细胞亚群与预后的关系及其与临床病理特征的相关性。结果：肺癌患者外周血CD4+T细胞低于健康体检者，而CD8+T细胞却较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；单因素分析显示T细胞亚群及NK细胞分布与预后并无显著关系（P＞0.05），而与淋巴结转移、TNM分期、肿瘤标志物等存在相关性（P＜0.05）。结论：肺癌患者外周血T亚群及NK细胞分布异常，动态监测患者外周血T细胞亚群及NK细胞有助于评估患者免疫功能，有望成为判断患者预后的一种指标。

肺癌 细胞免疫 淋巴细胞亚群 预后

Department of Public Laboratory,National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Thera

py,Tianjin,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This work was supported by the TianjinAnticancer Special Funds for Major Scientific Projects(No.12ZCDZSY15600)

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一［1］。有研究［2］表明免疫功能紊乱在其发生、发展过程中起重要作用。其主要的效应细胞为T细胞和NK细胞。本研究采用流式细胞术检测肿瘤患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及NK细胞表达水平，并与良性肺疾病及健康体检者进行对照，旨在揭示外周血T细胞亚群及NK细胞与肺癌患者临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2008年11月至2011年7月本院经病理学确诊、行T细胞亚群及NK细胞检测，且随访资料完整的肺癌患者102例。其中男性70例，女性32例；年龄41～89岁，平均年龄（61.8±10.5）岁。其中鳞癌39例，腺癌35例，小细胞癌12例，其他16例。TNM分期∶Ⅰ期26例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期34例。入组患者均经临床和实验室检查排除免疫系统疾病、近期使用免疫抑制剂及糖皮质激素史、糖尿病及非肿瘤疾病引起的免疫缺陷。随访截至2013年6月，生存时间为确诊之日到死亡日或随访截止日。收集同期住院治疗并行细胞免疫检测的肺良性疾病患者12例（其中炎性假瘤7例，结核球3例，错构瘤1例，感染1例）及健康体检者23例。受试者和（或）其家属均能理解本研究并签署知情同意书。

1.2 方法

采用EPIC-XL型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）对肺癌、肺良性疾病及健康体检者外周血中T细胞亚群及NK进行检测。小鼠抗人CD3-FTIC/ CD16+56（NK）-PE、CD4-FTIC/CD8-PE双标单克隆抗体及同型对照均购自美国贝克曼库尔特有限公司。具体方法如下∶用5 mL肝素钠抗凝负压真空采血管采受试者空腹静脉血2 mL，4 h内进行检测。取3个管分别标注A、B、C，取100 μL全血分别加入各管，于A管中加入20 μL同型对照，B、C管分别加入CD4/CD8、CD3/NK抗体20 μL，吹打混匀，室温避光孵育30 min；分别加入500 μL破红素，室温避光20 min；各管分别加入PBS缓冲液3 mL常规清洗细胞，1 500 rpm离心5 min，弃上清；各管分别加入500 μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测。用贝克曼公司配套软件获取1×104个淋巴细胞，分析CD3+、CD4+、CD8+T细胞及NK细胞占淋巴细胞百分比。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。检验数值用±s表示，验证原始数据符合正态分布且方差齐性后采用t检验或方差分析，生存资料采用Kaplan-Meier法计算生存率，Log-rank进行生存率显著性检验，Cox比例回归风险模型进行单因素分析，评价各因素对预后的影响。

2 结果

2.1 肺癌患者免疫细胞的分布

本组肺癌患者免疫细胞分布分析结果（表1）显示∶肺癌患者外周血CD4+T细胞低于健康体检者（P= 0.008），而CD8+T细胞比例较高（P=0.001），差异有统计学意义；CD3+T细胞比例低于健康体检者，NK细胞较健康体检者高，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。而T细胞亚群及NK细胞表达水平与肺良性疾病患者比较无显著性差异；肺良性疾病患者与健康体检者T细胞亚群及NK细胞表达水平亦无显著性差异（均P＞0.05）。

2.2 预后因素分析

对所有患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤位置、病理类型、肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期、有无肿瘤家族史、T细胞亚群及NK细胞的表达、肿瘤标记物、治疗方法等进行单因素分析，结果显示∶性别、吸烟史、肿瘤位置、有淋巴结转移、TNM分期、治疗方式及鳞状细胞癌相关抗原（SCC）升高是影响预后的因素。

2.3 T细胞亚群及NK细胞与临床病理特征及肿瘤标志物的关系

根据患者的临床病理特征进行分层，对肺癌患者外周血T细胞亚群及NK细胞数量水平进行分析。结果显示∶无淋巴结转移患者及TNM分期Ⅰ期患者CD4+T细胞水平显著高于存在淋巴结转移患者及分期较晚者；而存在淋巴结转移患者NK细胞却显著高于无淋巴结转移者；Ⅰ期患者NK细胞水平较低，但差异无统计学意义；肺癌患者外周血T细胞亚群及NK细胞表达水平与肿瘤标志物亦存在相关性（表2）。

表1 肺癌患者、良性疾病及健康对照者各淋巴细胞分布 %，±sTable 1 Lymphocyte distributions in lung cancer patients，patients with benign pulmonary disease，and healthy controls %，±s

Case 102 12 23 CD3+T 68.2±13.2 68.4±11.9 69.1±4.8 60 to 80 CD4+T 35.6±12.6* 35.3±10.6 40.9±5.7 30 to 50 CD8+T 33.7±11.2* 31.2±10.2 26.3±2.9 20 to 30 NK 17.8±12.6 13.5±8.4 16.3±2.6 10 to 20 Item Lung cancer Benign pulmonary disease Healthy controls Reference value *compared with healthy controls，P＜0.05

表2 免疫细胞分布与临床病理特征的关系 %，±sTable 2 The relationship of distribution of the immunology and clinicopathologic characteristics %，±s

Factor Nodal metastasis No Yes P Case Lymphocyte subset CD3+T CD4+T CD8+T NK 35 67 67.8±14.3 68.4±12.7 0.834 39.5±14.0 33.6±11.4 0.025 31.0±12.2 35.2±10.5 0.091 12.5±8.2 20.6±13.6＜0.001

表2 免疫细胞分布与临床病理特征的关系 %，±s（续表2）Table 2 The relationship of distribution of the immunology and clinicopathologic characteristics %，±s

CD8+T Case Factor TNM stage Lymphocyte subset CD3+T CD4+T NKⅠⅡⅢⅣP 26 15 27 34 68.5±12.8 65.4±16.5 67.4±12.6 69.9±12.8 0.727 42.0±14.9 32.0±13.1 35.3±11.4 32.7±9.8 0.018 30.0±11.1 35.2±12.8 34.9±8.6 35.0±12.3 0.292 12.4±8.5 17.6±13.1 21.6±13.619.1±13.1 0.051 Carcinoembryonic antigen Normal Above normal P Squamous cell carcinoma Normal Above normal P Cyfra21-1 Normal Above normal P 62 36 70.7±11.9 65.3±13.0 0.039 36.1±11.8 34.6±14.0 0.584 35.0±10.7 32.5±12.2 0.296 15.8±11.3 21.2±14.3 0.038 79 19 69.7±11.7 64.7±15.3 0.119 36.0±12.2 33.4±14.2 0.412 33.8±11.5 35.3±10.4 0.605 16.3±11.3 23.7±16.3 0.021 44 54 75.8±12.1 66.3±12.4 0.030 38.9±13.0 32.8±11.6 0.016 32.2±12.1 35.6±10.4 0.136 24.6±13.2 23.5±15.2 0.695

3 讨论

机体免疫功能低下或受抑制时肿瘤的发生率增高，肿瘤进行性生长时患者的免疫功能往往受抑制。不仅肿瘤的病理特征及患者所接受的治疗方法影响肿瘤的发展与转归，患者自身的免疫状态也起着重要的作用［3］。抗肿瘤免疫反应主要是细胞免疫反应，指经特异性细胞（T细胞亚群）及非特异性细胞（巨噬细胞、NK细胞）介导的免疫反应。外周血成熟的T（CD3+）细胞主要包括两种亚群，即MHC-Ⅱ类抗原限制CD4+的Th细胞和MHC-Ⅰ类抗原限制CD8+的Ts细胞。CD4+T协调B细胞分化产生抗体，CD8+T则抑制抗体的合成、分泌及T细胞的增殖，两者的稳态维持着机体正常的免疫应答。NK细胞在抗肿瘤免疫及限制恶性肿瘤扩散方面起着重要的作用，其来源于骨髓的大颗粒细胞，无需预先致敏即能分泌细胞毒因子杀伤肿瘤细胞［4］，能够对侵犯、转移的肿瘤细胞产生强大的杀伤作用，从而阻止肿瘤的早期扩散。正常情况下机体T淋巴细胞及各亚群数目相对稳定，在人体抗肿瘤免疫反应中起着重要作用。

3.1 免疫细胞分布

本组资料显示，与健康体检者比较，肺癌患者外周血总的T细胞（CD3+T）数量无显著性差异，而辅助机体完成抗肿瘤免疫的辅助性T（CD4+T）细胞表达明显降低，抑制免疫反应及抗体形成的细胞毒性T（CD8+T）细胞却显著升高，高于正常参考区间上限，与其他报道相似［5-7］。而肺癌与良性肺疾病患者之间T淋巴细胞亚群及NK细胞表达水平却未见显著性差异；良性肺疾病患者CD4+T表达水平较健康体检者低，CD8+T细胞稍高于健康体检者，但差异亦无统计学意义，与其他报道［8］不一致，这可能与本研究良性肺疾病患者较少，而且与文献所选择的良性疾病病种不同有关。本研究结果提示肿瘤患者机体免疫细胞分布异常，淋巴细胞各亚群间变化不平衡，进一步表明免疫功能紊乱、免疫力降低是肿瘤的发病因素之一。

3.2 预后因素

本组患者的1、2、3年生存率分别为80.4%、47.1%、23.4%，中位生存期为23个月。单因素分析结果显示，性别、吸烟史、肿瘤位置、有无淋巴结转移、TNM分期、治疗方式及鳞状细胞癌相关抗原（SCC）升高是影响预后的因素，与其他报道基本一致［9］。本研究显示性别及肿瘤位置亦为预后相关因素，考虑其原因可能为女性患者更倾向于腺癌，吸烟或既往吸烟者较少，腺癌的大体分型又多为周围型之故。而外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T及NK细胞的表达水平却与OS无显著相关性，与其他报道一致［10-11］。推测其原因可能为本组患者T细胞亚群及NK细胞的表达均为治疗前所测，而患者初诊时的分期不同，所接受的后续治疗也不同，这些差异或许弱化了淋巴细胞亚群分布与预后的关系。

3.3 免疫细胞分布与临床病理特征的关系

为明确肺癌患者免疫细胞分布与临床病理特征间的关系，本研究又根据性别、年龄、病理类型、肿瘤直径、有无淋巴结转移、TNM分期等分层分析了外周血T细胞亚群及NK细胞表达情况。结果表明，存在淋巴结转移患者CD4+T细胞降低而CD8+T细胞升高；TNM分期为Ⅰ期者的CD4+T细胞最高而CD8+T细胞比例则较低。由此可以看出，随疾病进展，辅助性免疫细胞不断减少，而免疫抑制性细胞却逐渐升高，与其他报道一致［8］。在乳腺癌等研究［12］中也得到了相似的结论。这提示随病情进展患者淋巴细胞各亚群间的变化更不平衡、细胞免疫功能进一步被抑制，淋巴细胞各亚群的分布与肿瘤的发生发展密切相关。另本研究结果显示有淋巴结转移患者NK细胞比例高于无转移者；不同TNM分期中，Ⅰ期患者NK细胞最低而Ⅲ期患者最高，与其他报道不同［13］。推测原因可能为本研究未检测NK细胞活性，而此恰是决定肿瘤发展和发生远处转移的重要原因。另外Eskinazi等［14］报道肿瘤细胞可产生可溶性因子诱导，引起NK细胞数量与功能相背离。庄宗杰等［15］研究亦发现各类型的恶性肿瘤患者NK细胞活性均低于正常人，且随着病情进展肿瘤扩散转移，NK细胞活性进一步降低。本研究结果还显示不同病理类型之间各指标的差异均无统计学意义，这可能提示T淋巴细胞亚群及NK细胞分布水平与肺癌病理类型无明显联系，而更与病情的严重程度密切相关。

总之，本研究结果表明肺癌患者外周血T细胞亚群及NK细胞分布异常，且随疾病的进展变化，提示免疫功能异常可能影响肺癌患者预后。而免疫细胞数量与功能及其功能状态与预后的关系还有待前瞻性的研究进一步证实。

1 Poleri C,Morero JL,Nieva B,et al.Risk of recurrence in patients with surgically resected stage I non-small cell lung carcinoma:histopathologic and immunohistochemical analysis[J].Chest,2003,123 (6):1858-1867.

2 Huang M,Stolina M,Sharma S,et al.Non-small cell lung cancer cyclooxygenase-2-dependent regulation of cytokine balance in lymphocytes and macrophages:up-regulation of interleukin 10 and down-regulation of interleukin 12 production[J].Cancer Res, 1998,58(6):1208-1216.

3 Grivennikov SI,Greten FR,Karin M.Immunity,inflammation, and cancer[J].Cell,2010,140(6):883-899.

4 Sun JC,Beilke JN,Lanier LL.Adaptive immune features of natural killer cells[J].Nature,2009,457(7229):557-561.

5 Wu XL.DNT cell lung cancer patients T cell subsets and clinical significance[J].J of Radioimmunology,20l3,26(1):84-85.[吴晓莲.肺癌患者DNT细胞、T细胞亚群检测及临床意义[J].放射免疫学杂志,2013,26(1):84-85]

6 Ling YH,Huang XQ.Expression and its clinical significance of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with lung carcinoma[J].Practical Preventive Medicine,2009,16(1):229-230.[林英辉,黄小琪.肺癌患者外周血T细胞亚群的表达及其临床意义[J].实用预防医学,2009,16(1):229-230.]

7 Hamakawa T,Kurokawa Y,Takiguchi S,et al.Combination chemotherapy using docetaxel,cisplatin,and S-1 for far advanced gastric cancer[J].Gan To Kagaku Ryoho,2011,38(12):2342-2344.

8 Jing JH,Yan JH,Lu SF,et al.Significance of peripheral blood T lymphocyte subsets and NK cells detection in lung cancer diagnosis and treatment[J].Cancer Research and Clinic,2013,25(2):90-93.[江金华,严汀华,卢穗万,等.外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞检测在肺癌诊断及治疗中的意义[J].肿瘤研究与临床,2013,25(2):90-93.]

9 Jde Cos JS,Miravet L,Abal J,et al.Lung cancer survival in Spain and prognostic factors:a prospective,multiregional study[J].Lung Cancer,2008,59(2):246-254.

10 Nakamura H1,Saji H,Ogata A,et al.Immunologic parameters as significant prognostic factors in lung cancer[J].Lung Cancer,2002, 37(2):161-169.

11 Zhang RP,Xu BX,Wang SL,et al.The correlation of regulatory T cells with prognosis in non small cell lung cancer patients[J].Modern Oncology,2013,21(3):521-524.[张瑞萍,徐冰心,王社论,等.晚期非小细胞肺癌调节性T细胞与预后的关系[J].现代肿瘤医学,2013, 21(3):521-524.]

12 Morton BA,Ramey WG,Paderon H,et al.Monoclonal antibody-defined phenotypes of regional lymph node and peripheral blood lymphocyte subpopulations in early breast cancer[J].Cancer Res,1986,46(4 Pt 2):2121-2126

13 Wang LL,Shi L.The effect of combined chemotherapy with pemetrexed and cisplatin on T lymphocyte subsets and NK cells in the peripheral blood of patients with advanced non-small-cell lung cancer(grandular cancer)[J].Journal of Shandong Medical College, 2012,34(6):407-410.[王丽丽,石 磊.培美曲塞联合顺铂化疗对晚期非小细胞肺癌(腺癌)患者外周血T细胞亚群及NK细胞的影响[J].山东医学高等专科学校学报,2012,34(6):407-410.]

14 Eskinazi DP,Perna JJ,Mihail R.Mononuclear cell subsets in patients with oral cancer[J].Cancer,1987,60(3):376-381.

15 Zhuang ZJ,Li YQ,Gao JY,et al.Study 139 cases of malignant peripheral blood natural killer cell activity[J].Chinese Journal of Pathophysiology,1985,10(1):15-18.[庄宗杰,李永琴,高炯源,等.139例恶性肿瘤患者外周血自然杀伤细胞活性的研究[J].病理生理学报,1985,10(1):15-18.]

（2013-08-08收稿）

（2013-11-08修回）

（本文编辑∶邢颖）

The correlation of peripheral blood lymphocyte subsets with prognosis in lung cancer patients

Xiyin WEI,Cuicui ZHANG,Fenglin ZANG,Kai LI
Correspondence to:Kai LI;E-mail:likai5@medmail.com.cn

Objective:To study the relationship of lymphocyte subsets with prognosis and clinico-pathologic features in lung cancer patients.Methods:Flow cytometry was used to analyze the distribution of T-lymphocyte subsets and natural killer cells in the peripheral blood of lung cancer patients,patients with benign pulmonary diseases,and healthy controls.The peripheral-blood lymphocyte levels of the subjects were compared.Clinical data obtained from 102 lung cancer cases were reviewed retrospectively,and the relationship of lymphocyte subsets with prognosis and clinico-pathologic features was analyzed.Results:The level of CD4+T cells was lower in the peripheral blood of lung cancer patients than that of the healthy controls(P＜0.05);however,the level of CD8+T cells was higher in lung cancer patients than in the healthy controls(P＜0.05).Univariate analysis revealed that T-lymphocyte subsets and natural killer cells were not influential factors in the overall survival of lung cancer patients(P＞0.05).However,the abnormal distribution of lymphocyte subsets was related to lymphatic metastasis,TNM stage,and tumorigenesis P＜0.05).Conclusion:The distribution of T-lymphocyte subsets and natural killer cells was abnormal in the peripheral blood of lung cancer patients,and the dynamic changes in distribution can help assess the immune functions of lung cancer patients.Cellular immune function can act as a prognostic indicator in lung cancer patients.

lung cancer,cellular immune function,lymphocyte subsets,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20131278

魏熙胤 研究方向为流式细胞术应用。

天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（天津市300060）

*本文课题受天津市科委抗癌重大专项攻关计划（编号：12ZCDZSY15600）资助

李凯 likai5@medmail.com.cn

E-mail∶weixiyin@126.com