大鼠力竭运动诱导的氧化应激损伤对红细胞变形性的影响*

熊延连，熊艳蕾，李遥金，唐福州，王若峰，赵押金，王 翔

合理适当的运动能够降低多种疾病的发病率与死亡率［1-2］。而运动对相关心血管因素的改善作用被认为是这种保护作用的基础。与此相反，运动诱导的猝死等疾病被认为与多种心血管功能障碍有直接关系。在运动诱导的猝死病例中，往往伴随着心室纤颤等心律失常的现象［3］。目前，学术界普遍认为运动导致的冠状动脉痉挛、血栓等现象所导致的心肌局部供血不足是诱导致命性心律失常的最主要病因［3］。然而，对心血管畅通和气体运输起着至关重要作用的红细胞的相关功能是否在运动过程中发生改变，运动诱导的多种心血管疾病与红细胞功能损伤之间的关系仍有待研究。

本文通过对不同运动条件下细胞抗氧化能力改变，及不同细胞组分受氧化损伤程度的检测评估了自由基诱导的运动性氧化应激对大鼠红细胞的影响。对膜蛋白巯基水平、膜脂质过氧化水平和膜蛋白SDS-Page电泳条带变化进行了分析。此外对不同剪切力下红细胞变形性（elongation index，EI）进行了检测。通过上述研究为力竭运动条件下由于组织局部缺血缺氧导致的休克、死亡等运动性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

肝素钠和PVA购于美国Sigma公司；电泳设备及相关耗材购于美国 Bio-rad公司。过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SH及 DMA检测试剂盒均购于南京凯基生物公司；激光旋转细胞变形仪LORCA购自荷兰RR Mechatronics公司；动物跑台购自淮北正华公司。

1.2 实验动物与分组

选用雄性SD大鼠30只（8周龄，体重200～250 g，第三军医大学提供），国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食及饮水。相对湿度45%～55%，室温（22±5）℃，光照时间 8：00～20：00的条件下饲养。适应性喂养5 d后，大鼠随机分为3组（n＝10）：对照组（control，C），适度运动组（moderate running exercise，MRE）和力竭运动组（exhaustive running exercise，ERE）。

大鼠跑步运动在特制的跑台上进行，动物跑台由马达驱动，可调节跑步速度和坡度。力竭运动组大鼠运动参照Davies等的运动模型［4］，大鼠运动的前20 min保持5%的坡度和20 m／min的速度，20 min后调整为15%的坡度和25 m／min的速度，直至运动力竭。力竭标准参照Thomas等的报道，置于平面后不能完成翻正反射。适度运动组大鼠在5%的坡度和20 m／min的速度下跑40 min。对照组大鼠静坐于跑台中，不进行运动。

对照组和运动组的大鼠采用心脏取血的方法采集血液。用 PBS洗涤4次然后3 000 r／min离心3 min，获取红细胞，冷冻备用。

1.3 红细胞膜蛋白提取

取1ml洗涤后的压积红细胞置于60ml预冷至4°C的低渗磷酸缓冲液（pH 7.4，7.5mmol／L磷酸缓冲液）中，加入20μmol／L PMSF抑制水解蛋白酶活性，混合均匀后在4°C下破溶1.5 h。然后20 000×g离心20min，洗涤4～5次后此得到白色的 RBC膜，BCA法测定膜蛋白浓度。

1.4 CAT、SOD、GSH、膜蛋白 SH与膜脂 DMA检测

按照试剂盒操作说明，样品提取好后，加入DTNB反应液，后测412 nm处吸光值。并通过标准曲线计算胞内GSH与膜蛋白SH含量。

在红细胞裂解液中加全血体积2倍的无水乙醇（2ml），在漩涡振荡器上充分混匀30 s。再加全血体积2倍的三氯甲烷（2 ml）漩涡振荡器上充分混匀1min，1 500×g离心10 min。取上层液体（CAT与SOD抽提液），按照试剂盒操作说明检测 CAT与SOD活力。

膜脂质过氧化程度通过TBA试剂盒检测。取上述裂解液100μl为加样量，空白组则不加TBA反应液，以532 nm处的净吸光值计算MDA浓度。脂质过氧化程度产物以每毫克血红蛋白所对应的 MDA含量表示。

1.5 红细胞膜蛋白SDS-Page电泳

电泳采用5%～15%的线性梯度胶，还原性电泳样品经含DTT的上样缓冲液充分还原后上样，非还原性电泳样品缓冲液不含DTT，上样量为5μg。电泳条件为70 V转120 V恒压电泳。考马斯亮蓝R250染色，凝胶经脱色后用GS-800 Calibrated Densitometer扫描成像，Quantity One软件进行条带分析。

1.6 红细胞变形性检测

提前打开仪器预热30 min，使内部温度达到37℃后进行检测。取10～20μl压积RBC，加入1ml 15%PVP溶液（mol wt 360 000；Sigma，St.Louis，MO），混匀。通过激光照射旋转中的红细胞，根据激光衍射图谱计算红细胞在3 Pa和30 Pa剪切力下的伸长指数（elongation index，EI）：

公式中L和W分别为衍射图的长度和宽度。红细胞EI值越大，代表它在相同剪切力作用下形变越大，具有更好的变形性。

1.7 统计学处理

所有数据都从3组或3组以上的重复实验中得出，以均值±标准差（¯x±s）的形式表示。组间统计学显著性差异通过 Origin 7.5软件的 one-way ANO-VA分析。

2 结果

2.1 运动对大鼠红细胞抗氧化能力的影响

我们对不同运动条件下大鼠红细胞中3种代谢物质的检测结果表明：与对照组和适度运动组相比，力竭运动导致大鼠红细胞酶类抗氧化物SOD（P＜0.05，表 1）和 CAT（P＜0.01）活性的显著升高，于此同时，大鼠红细胞内GSH含量显著下降（P＜0.01）。在适度运动状态下，大鼠红细胞抗氧化能力与对照组并无显著性差异。

Tab.1 Erythrocyte antioxidant parameters in different exercised groups（¯x±s，n＝10）

2.2 运动对膜脂质过氧化和膜蛋白巯基含量的影响

我们通过TBA法检测膜脂质MDA水平，结果表明，力竭运动导致大鼠红细胞膜脂过氧化产物MDA水平显著升高（P＜0.01，表 2）。红细胞膜蛋白含有丰富的SH，它们对维系RBC膜上众多酶类和功能蛋白的正常结构功能起到重要作用。与对照组（C）相比，力竭运动后红细胞膜蛋白SH含量显著下降（P＜0.05）。在适度运动状态下，大鼠红细胞脂质过氧化程度和膜蛋白巯基含量与对照组相比并无显著性差异。

2.3 运动对大鼠红细胞膜蛋白电泳条带的影响

在非还原性SDS-APGE电泳结果中我们发现，力竭运动后红细胞膜上出现高分子聚合条带（high molecularweight，HMW），与此同时，许多小分子条带丰度显著降低或消失（图1箭头所示）。而在普通运动组和对照组HMW的含量非常少。还原性SDSAPGE电泳结果中各组条带差异不明显，力竭运动组的HMW条带基本上消失。

Fig.1 SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis）analyses of erythrocytemembrane proteins in different groups HMW：High molecular weight；C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group.The arrows indicate protein clusters or degradation after exercise-induced oxidative stress

2.4 运动对红细胞变形性的影响

如图2所示，在3 Pa（A）和30 Pa（B）条件下，力竭组大鼠红细胞变形性（EI分别为0.314±0.013 at 3 Pa and 0.534±0.009 at 30 Pa）显著低于对照组（0.41±0.01 at3 Pa and 0.571±0.008 at30 Pa；P＜0.05 and P＜0.01，respectively）和适度运动组。为了探讨蛋白交联与运动诱导的氧化损伤之间的关系，我们对各组大鼠红细胞在含5.0mmol／L二硫苏糖醇 （dithiothreitol，DTT）的缓冲液中孵育30min。结果表明，DTT处理后力竭组红细胞变形性出现显著回复（P＜0.05）。在适度运动状态下，大鼠红细胞脂变形性与对照组相比并无显著性差异。

Fig.2 RBC deformability as reflected by the elongation index in different groups under shear stressof3 Pa（A）and 30 Pa（B）C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

3 讨论

运动，尤其力竭运动过程中机体产生大量自由基，导致包括肌肉、心血管损伤在内的多种运动性氧化应激反应［5-7］。在对运动性氧化损伤的研究过程中，红细胞因其在机体内清除自由基、维系氧化还原平衡过程中所起的重要作用逐渐受到人们的关注［8-10］。研究力竭运动过程中红细胞抗氧化、清除自由基能力的变化，自身受到氧化损伤程度的变化，以及氧化应急条件下红细胞力学性质和携氧功能的改变将对运动诱发的休克、缺氧损伤、红细胞凋亡等多种生理和病理现象的探索提供重要的理论依据。

红细胞内拥有包括酶类和非酶类抗氧化物在内的抗氧化体系。正常情况下，它们协同作用能够清除包括 H2O2、O·2-和 OH·在内的绝大部分自由基，维持细胞的氧化还原平衡。本实验中，力竭运动后大鼠红细胞内GSH含量显著降低，表明伴随着运动强度的增加红细胞通过GSH维系氧化还原平衡的能力逐渐减弱。这种削弱一方面是由于清除自由基过程中GSH的大量消耗；另一方面，由于红细胞内GSH-GSSH循环体系的还原力主要来自于糖代谢HMP途径产生的NADPH。由此推测，在力竭运动过程中红细胞的能量代谢途径也可能发生相应改变。

RBC膜上有很多蛋白和酶类以半胱氨酸残基作为必须氨基酸，自由基攻击导致的SH氧化交联可损伤上述蛋白及酶的功能，从而导致红细胞结构破坏和功能紊乱。本研究室的前期工作表明，人红细胞膜蛋白SH水平与RBC粘弹性呈正相关关系［11］。由此可见，红细胞膜蛋白SH水平在维系RBC功能的过程中起着至关重要的作用。本实验中，力竭运动后大鼠红细胞膜SH含量显著降低，表明在力竭运动过程中自由基攻击导致膜蛋白SH交联产生-SS-。SH含量的降低一方面表明红细胞膜蛋白通过膜上大量巯基集团抵抗氧化损伤能力的降低；另一方面，也意味着红细胞膜蛋白已经受到ROS攻击而发生结构上的改变。此外，力竭运动后大鼠红细胞脂质过氧化产物MDA水平高出对照组和适度运动组一倍以上。表明在力竭运动过程中大鼠红细胞膜脂质发生了严重的脂质过氧化反应。由于膜流动性与膜脂肪酸的饱和程度密切相关，PUFA的氧化将导致红细胞流动性的下降。此外，脂质过氧化过程中生成的ROS将诱导红细胞膜组分（如膜酶和膜骨架蛋白）的进一步损伤。

正常情况下，由于体内存在一定数量的衰老红细胞，在非还原性电泳条带中都会有少量高分子聚合物条带的出现。然而，在力竭运动组电泳条带中可明显地看到HMW条带的出现，而且伴随着包括Band 3在内的多种小分子条带的减弱与消失。而在含有DTT的还原性SDS-PAGE电泳中，力竭运动组HMW条带显著的减弱。由于DTT常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。这意味着力竭运动所诱导的蛋白聚集主要是通过-S-S-键连接。-SH的氧化交联会对红细胞形态结构的稳定和多种代谢功能造成严重损伤。有研究表明，红细胞膜蛋白-SH水平与细胞粘弹性呈正相关关系。在本实验中，力竭组红细胞-SH的大量减少，诱导细胞膜蛋白交联的同时红细胞变形性与携氧功能都出现了显著地降低。而在对细胞进行体外还原处理后，膜蛋白交联程度明显减弱，与此同时，红细胞的变形能力与携氧功能都出现了明显的恢复。由此可见，由自由基攻击所引发的膜蛋白巯基交联所导致的多种膜蛋白的损伤是力竭运动诱导的红细胞结构和功能性损伤的重要原因。

红细胞的变形能力是影响血液流动和粘滞性的最主要因素［12］。红细胞良好的变形性是保障机体微循环畅通，生理功能健全，以及维持生命运动的基础。在多种生理病理情况下，由红细胞变形性下降诱导的微循环障碍，尤其是在代谢活跃的器官（心、脑、肺）这种影响更加明显。洪平等实验发现，适度运动条件下模拟平原训练和高原训练都能提高SD大鼠RBC变形性［13，14］。本实验中，由于进行的是一次性运动，适度运动组大鼠红细胞变形性并未发现显著提升。此前有研究表明，耐力运动可降低血管一氧化氮合酶活性，对动脉粥样硬化内皮细胞分泌功能产生有益影响［15］。而本实验中，力竭运动后大鼠RBC变形性显著下降，这与之前的研究结果相吻合［16］。此外，为了揭示力竭运动诱导红细胞变形性下降的原因，本研究对各组红细胞进行了DTT处理。结果发现，处理后红细胞变形性出现明显的恢复。由于DTT具有极强的还原性，常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键，对红细胞的膜蛋白巯基具有极强的保护作用。这也就意味着，力竭运动过程中红细胞变形性的降低与氧化应激引起的膜蛋白巯基交联有密切关系。

综上，本研究发现一次性力竭运动能够诱导大鼠红细胞产生严重的氧化应激反应，进而影响红细胞变性能力，成为力竭运动诱导的多种心脑血管疾病发生的潜在致病因素。本研究对力竭条件下由组织局部缺血缺氧所导致的休克、死亡等运动性疾病的研究提供了理论依据。

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