代谢组学分析技术在中药毒理研究中的应用△

杨中良，杨秀云，李剑，周怡，曲晓璐，刘卫东

(1.上海市浦东新区浦南医院 中西医结合科，上海 200125； 2.上海市蓝十字医学科学研究所，上海 200125； 3.浙江省立同德医院 内科，浙江 杭州 310012)

综 述

代谢组学分析技术在中药毒理研究中的应用△

杨中良1，2，杨秀云1*，李剑1，周怡1，曲晓璐1，2，刘卫东1，2

(1.上海市浦东新区浦南医院 中西医结合科，上海 200125； 2.上海市蓝十字医学科学研究所，上海 200125； 3.浙江省立同德医院 内科，浙江 杭州 310012)

近年来，中药毒性问题已经越来越受到关注，代谢组学单一分析技术已用于中药药理和毒性反应研究，且取得了一定的成果。但是，这些分析技术各有优缺点。多分析技术可克服单一分析技术的部分缺点，如气相色谱-质谱技术(GC-MS)和液相色谱-质谱技术(LC-MS)代谢轮廓方法已经揭开了马兜铃酸诱导的肾毒性机理。随着代谢组学技术特别是多分析技术的开发和应用，将大大促进中药毒理研究和安全评估工作，有助于中药安全评估规范的构建和国际标准指标的建立。

代谢组学；中药；毒性；核磁共振；色谱法；质谱法

近年来关于中药毒性反应事件时有报道，中药面临严峻挑战[1]，有必要加强中药毒理研究。但是中药组分及其作用机理的复杂性使单纯采用中药安全评估方法研究显得困难。代谢组学从代谢网络终末症状全面反映生物体的功能，并分析由各种外界刺激引发的代谢变化[2]，与中医的整体观相一致，在中药毒性研究中发挥越来越重要的作用。笔者对近年来广泛用于中药现代化研究中的各种代谢组学分析技术进行综述，并对其在中药毒理研究方面的应用进行初步总结。

1 应用于中药现代研究中的代谢组学技术

代谢组学技术大致分为核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)、色谱法(chromatograpy)、质谱法(mass spectrometry，MS)。其中有许多分析技术已经广泛用于中药现代化研究，如液相色谱法(liquid chromatography，LC)、气相色谱法(gas chromatography，GC)及毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)等。

1.1 NMR技术

自从1999年Nicholson引入NMR代谢组学技术以来[3]，NMR已经成为代谢组学研究中最常用的一种技术，可提供代谢物分子结构及分子动力学方面的详细信息[4]。与MS和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)相比，NMR方法具有对样本的非破坏性分析、高通量、不需太多样本准备、分辨率高和重现性佳等优点，但敏感度相对较低[5]。NMR方法适用于中药等复杂代谢物成分的分析。

1.2 液相色谱法

1.2.1 高效液相色谱法 HPLC因具有操作简便、敏感、价廉、不受样本挥发性和稳定性影响及分离能力强等优点，广泛用于生物样本分析和中药现代化研究[6]。但是，这种方法未与化学计量学结合在一起，难以进行整体样本的指纹分析。近年来，开发了一系列改良HPLC法，用于中药指纹分析和中药现代化研究，如毛细管HPLC(capillary HPLC，CHPLC)用于中药活性成分的定量和定性检测[7]，超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)用于识别中药的活性成分[8]。

1.2.2 多维液相分离系统 诸如中草药、尿液、血浆等复杂样本不可能采用单一色谱柱来保留或分离所有种类的代谢物。采用2个及以上液相色谱分离模式的多维液相分离系统为一种有前景的方法，与单维HPLC相比，具有分离能力强、分辨力和敏感性高及检测能力强等优点。至今已经有数个多维液相分离系统得到开发，并有效应用于中药混合物的分离和识别，如二维液相色谱法(LC×LC)用于补骨脂[9]和大黄[10]的分离等。

1.3 气相色谱法

气相色谱法(GC)主要用于中药、尿液、血浆和血清等生物学样本挥发性化合物的分析。Chen等[11]使用大剂量氢化考的松建立肾虚证大鼠模型，并将GC和多元统计技术用于数据分析。结果发现，以氢化考的松处理的大鼠尿液出现了明显的生物化学变化。中医学认为肾虚证为肥胖和糖尿病的早期表现，GC可用于肥胖和糖尿病等代谢综合征的早期诊断。

1.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)也称为高效液相毛细管电泳法(high performance HPCE)，于20世纪80年代初引入中国[12]，此后快速发展成为一种有效的分离和纯化工具。与HPLC相比，HPCE具有高效、快速、溶剂和样本消耗少、分离效率高和容易实现自动化等优点[13]，但HPCE总敏感性大约比HPLC低两个数量级。尽管如此，HPCE在中草药和中药制剂的成分识别、分析及中药指纹图谱的建立[14]等方面仍具有光明的前景。

1.5 质谱分析法

质谱分析法(MS)常与其他分离技术联合使用。MS检测敏感性和选择性高，可对多个分析物进行分析，提供代谢物结构信息[15]，但具有侵袭性、样本破坏性、样本需水解或衍生预处理、检测费用高及设备昂贵等缺点。但MS与LC联用时能克服上述缺点，可用于中药毒性研究，MS与GC联用已经成为识别和定量分析挥发性和热稳定性化学成分的金标准[16]。

2 代谢组学技术在中药毒理研究中的应用

近年来，国内外有关中药不良反应的报道不断增加[1，17]，中药安全性问题更受到国际关注，代谢组学在中医毒理学研究中已经发挥越来越重要的作用。

2.1 单一分析技术

目前，普遍采用NMR、GC、MS和LC等单一分析技术对中药作用靶器官、作用模式及机理等进行研究。至今，已完成对许多种中药的代谢组学研究。

2.1.1 马兜铃酸 含有马兜铃酸毒性成分的中药引起肾毒性是中药毒性研究中最受关注的话题之一。Zhang等[18]通过NMR谱图分析显示，马兜铃酸可引起Wistar大鼠肾近曲小管和乳头损害及轻度肝损害，重者可引起肾功能衰竭，即为马兜铃酸肾病[19]。通过对起病、发展及部分恢复的毒理过程进行监测，发现马兜铃酸诱发的肾毒性为时间依赖性和剂量积聚过程。

2.1.2 朱砂和雄黄 Wei等[20]联合应用1H-NMR谱图、肝肾组织病理学检查和血清生化分析，分别研究朱砂和雄黄对大鼠的毒理机理，发现这两种中药呈现时间依赖形式，可干扰能量代谢、损伤氨基酸代谢及影响胃肠微生物种群环境。同时发现，谷胱甘肽可能是雄黄引起生物体氧化损伤的生物标志物。

2.1.3 乌头 Li等[4]采用基于NMR的代谢组学方法研究黑参片即毛茛科乌头外侧根对大鼠代谢轮廓的作用，探索黑参片的毒性机制。实验发现高剂量和中剂量组尿液牛磺酸水平在用药早期即呈戏剧性下降，随后牛磺酸水平逐渐上升，实验结束时达到原来水平。该项研究中，大鼠尿液中牛磺酸水平下降，柠檬酸、葡萄糖和氨基酸水平的变化，提示黑参片有心脏毒性。

2.1.4 雷公藤 Li等[21]采用NMR、模式识别技术和主成分分析法(PCA)，研究口服雷公藤内酯醇对大鼠尿液代谢物的影响。结果显示，用药后尿中乙酸、甜菜碱和丙酮浓度升高，提示肾皮质和肾乳头受损伤。PCA分析显示雷公藤处理组大鼠的代谢轮廓与对照组明显不同，其与雷公藤内酯醇的肾毒性紧密相关。

2.2 多分析技术

采用多种代谢组学分析技术并结合不同数据库，全面了解中药引起生物系统内复杂的生物化学变化，可以捕捉具有特殊生物学意义的内源性代谢物。与单分析技术相比，多分析技术接近于所谓的“万能分析”。

GC与MS联合即GC-MS可使检测敏感性提高，可以便捷获取中药干预后代谢成分相关信息，已广泛应用于中药代谢指纹分析。但是，GC-MS分析技术存在耗时费劲和样本浪费的问题[22]，且其所分析的代谢物须是挥发性，多数生物分子需要化学衍生化过程。与GC-MS不同，LC分析法排除了样本挥发性和稳定性的限制，分离能力更强，敏感性更高，但此法提供的信息比较有限，易受到样本基质的影响[23]。GC-MS与LC联合应用可充分利用这两种技术的优点，中药毒性研究时可提供更全面的信息[5]。

Li等[24]联合应用NMR、GC和MS技术研究原发性高血压阴虚阳亢证和阴阳两虚证两个亚型的代谢机理。研究发现，糖代谢异常可能是两型高血压的主要共同通路，交感神经系统激活在阴虚阳亢型中起重要作用，而低代谢率常发生于阴阳两虚型高血压中。Lu等[8]采用UPLC联合MS技术，分析大剂量氢化考的松诱发的肾阳虚证代谢组学特征及骨碎补的治疗作用。结果发现，苯丙胺、苯乙酰甘氨酸、N-琥珀酰鸟氨酸、L-脯氨酸、肌酐、马尿酸和柠檬酸等代谢物发生了明显的变化，提示能量代谢、氨基酸代谢和胃肠道微生物种群的代谢障碍，有利于进一步了解肾阳虚证及骨碎补的药效机理。Ma等[25]采用UPLC-MS技术分析牵牛子处理的大鼠尿标本，结果提示牵牛子乙醇提取物可引起大鼠尿液8种内源性代谢物发生显著变化，可能通过干扰代谢通路潜在调节机制而引起肾功能损害。

Dai等[26]采用NMR联合LC-二极管阵列-MS(LC-DAD-MS)分析法，对3个丹参品种的代谢组学进行分析，发现丹参代谢组中含有糖、氨基酸、羧酸等28个初级代谢物和4个次级酚类代谢物，其中N-乙酰谷氨酸、天冬氨酸和富马酸首次在这种植物中发现。同一品种因产地不同其代谢组物也不同，说明丹参代谢组物对生长环境生态的依赖性，LC-MS联合法有助于植物代谢组学的表型分析。

3 代谢组学的应用前景

近年来，中药毒性问题已经引起广泛关注，进而引发很多中药相关的毒理研究。随着中药现代化的实施，亟需制定中药安全评估规范。代谢组学为中药安全评估提供了一种新型技术手段，但这些分析技术或多或少存在缺点和不足。随着现有分析技术的开发和新型技术的出现，及公众对其更加深入的了解，基于不同分析技术的代谢组学将在中药毒性研究中发挥越来越重要的作用。

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TheApplicationofMetabonomicsAnalyticalTechnologyintheToxicologicalResearchofTraditionalChineseMedicine

YANG Zhongliang1，2，YANG Xiuyun1*，LI Jian1，ZHOU Yi1，QU Xiaolu1，2，LIU Weidong1，2

(1.DepartmentofIntegrativeMedicine,ShanghaiPunanHospitalinPudongNewDistrict,Shanghai200125,China; 2.ShanghaiBlueCrossResearchInstituteofMedicalScience,Shanghai200125,China; 3.DepartmentofRespiratoryMedicine,TongdeHospitalofZhejiangProvince,Hangzhou310012,China)

In recent years，the toxicity of Traditional Chinese Medicine (TCM) has obtained increasing concern，while single technology of metabonomics has been applied in the research of TCM pharmocological effect and toxicological reaction and has already gained considerable achievements.But almost each of these metabonomic analytical tools has both drawbacks and advantages.Multiple analytical tools，such as metabonomic profile methods of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) have revealed the mechanism of renal toxicity induced by aristolochic acid.Further development and application of metabonomic tools，especially multi-analytical tools will greatly facilitate the toxicological study and safety evaluation of TCM，as well as the construction of TCM safety evaluation norms and international standard parameters.

Metabonomics；Traditional Chinese Medicine；Toxicity；Nuclear magnetic resonance；Chromatography；Mass spectrometry

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.019

2013-12-20)

上海市卫生局中医药开发研究基金课题(2011XY011)；2012年度上海市中西医结合学会科研基金课题(ZXYQ-1235)

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杨秀云，主任医师，研究方向：呼吸系统疾病的中西医结合治疗；E-mail：yangaxiu@tom.com