冠心病生物标记物血清microRNA的研究进展

陈小良 廉姜芳 周建庆

冠心病生物标记物血清microRNA的研究进展

陈小良 廉姜芳 周建庆

microRNA（miRNA）是一类长度约21～24个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA，在基因转录后水平发挥细胞生长调控作用。miRNA不仅在细胞分化、生长、凋亡及机体的正常发育中发挥重要作用，还参与包括冠心病、心律失常、心力衰竭等多种心血管疾病的发生、发展过程[1-2]。研究表明miRNA可在血清中稳定存在，与组织标本来源的miRNA相比，血清miRNA具有采样方便、稳定性好、灵敏度高、可连续监测等优势，成为近年冠心病早期诊断标记物的研究热点之一。本文就血清miRNA作为冠心病诊断标记物的研究进展作一综述。

1 血清miRNA概述

相关研究表明，miRNA可在外周血中稳定存在。血液中存在降解RNA的核酸酶，但血清中的miRNA可耐受核酸酶的消化，保持稳定[3]。miRNA在室温、反复冻融、煮沸、久置、强酸（pH=1）强碱（pH=13）等条件下，均可保持稳定[4]。

血清miRNA的来源，目前有学者认为来自于坏死或凋亡的细胞，细胞坏死后释放组织细胞特异性表达的miRNA入血，致特定疾病状态下特定miRNA表达的明显改变；另有学者认为是来自于细胞主动释放，miRNA能进入微泡、核外体、凋亡体等囊泡中或与Argonaute2（Ago2）蛋白、高密度脂蛋白（HDL）等形成miRNA-蛋白质复合物，通过循环转移到邻近或远处的受体细胞进而产生生物效应[5-7]。

血清miRNA保持稳定的机制主要有：（1）形成微泡：分泌到血液中的miRNA被包裹在脂质泡中，形成微泡，从而免受血清中RNA酶的降解，且微泡表面带有识别靶细胞的特异性受体或配体，可转运miRNA至靶细胞，发挥调节功能[5]；（2）形成蛋白复合物：血清miRNA以蛋白复合体的形式存在。Arroyo等[6]研究发现，miRNA与Ago2蛋白结合形成Ago2-miRNA蛋白复合体，可保护miRNA不被RNA酶降解。近年来有研究发现，有另两种miRNA结合蛋白：核磷蛋白（nucleophosmin 1，NPM1）[8]和HDL[7]也可介导部分miRNA从胞内释放至胞外，并保护miRNA不被RNA酶降解。miRNA在血清中的稳定存在，为血清中miRNA的检测提供了可能。

2 血清miRNA的检测方法

目前血清miRNA的检测方法主要有Northern杂交技术、实时荧光定量PCR、高通量序列分析法、基因芯片法等。Northern杂交技术操作繁琐、样本量需求大、灵敏度较低，一般不用于临床样本的检测。实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异度和重复性，已成为现阶段核酸分子定量检测的金标准，可精确地定量分析miRNA的表达,是目前基础及临床研究中最常采用的血清miRNA检测方法。根据引物的不同，实时荧光定量PCR可以分为茎环法和加尾法，茎环法特异度较高。高通量序列分析法具有高通量、准确度高的特性，但数据量大、价格较昂贵，一般只用于新miRNA的筛选。基因芯片法又称微阵列，具有快速、高通量的特性，但存在背景及混杂信号干扰，重复性较差，用于miRNA的初筛，其结果还需采用实时荧光定量PCR等方法加以验证。

3 血清miRNA用于冠心病诊断的种类与机制

冠心病作为对人类健康威胁最大的疾病之一，对其作出早期准确的诊断，并给予积极有效的干预能够很好的改善预后。生物标记物的研究在心血管系统疾病中研究最多的就是冠心病，尤其是在急性心肌梗死（AMI）中。虽然心肌肌钙蛋白（cTn）对心肌坏死具有很高的敏感度及特异度，但对于4h以内的AMI诊断仍具有一定的局限性。寻找更为快速、敏感、特异的心肌标记物成为目前研究的热点。最近研究发现血清中TNF-α和IL-8的表达水平在心绞痛和心肌梗死中均显著升高且存在差异性[9]；翁秀妹等[10]也发现血清骨保护素水平在慢性冠心病中显著升高且与冠状动脉狭窄的严重程度密切相关。血清miRNA也有着作为理想标记物的重要特征：在外周血中稳定存在、获取简便、样本易得、组织及疾病特异性、用实时荧光定量PCR的方法容易测量。目前发现与冠心病相关的血清miRNA很多，其中研究较多的有miR-1、miR-133、miR-499、miR-126和miR-155等。

3.1 miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中特异性表达，分为miR-1-1和miR-1-2。miR-1-1主要参与心脏发育和肌肉分化。Cheng等[11]发现通过结扎冠状动脉左前降支造成AMI的小鼠血清中miR-1水平与对照组相比在心肌梗死后6 h升高了 200倍，心肌梗死3d后miR-1降至正常水平，并且心肌梗死小鼠血清中miR-1水平的升高与其心肌梗死面积呈正相关。同时，他们通过临床研究还发现AMI患者血清miR-1水平与对照组相比在心肌梗死后6h升高了100倍，且其血清miR-1水平的升高与CK-MB水平的升高呈正相关,结果表明miR-1和CK-MB的表达水平表现出相同的趋势。这些预示着miR-1有可能为AMI新一代的标记物。

3.2 miR-133 miR-133有miR-133a和miR-133b两种亚型，与编码miR-1的基因处于同一条染色体的相邻位置，也特异性表达于心肌和骨骼肌细胞中，参与多种心血管疾病的发生、发展。

D’Alessandra等[12]的研究发现大鼠冠状动脉闭塞6h后，梗死区miR-1、miR-133的表达水平均下降；而在血清或血浆中检测到miR-1、miR-133和miR-499-5p的水平则增高，说明miR-1、miR-133在心肌损伤后才释放入血，并在心肌梗死患者出现症状后156min后即能检测到miR-1、miR-133高峰值，且此数值比cTn I峰值来得更高、更早。Eitel等[13]对126例ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者进行研究，也发现血清miR-133a水平的升高与心肌损伤修复、损伤面积的扩大和再灌注损伤密切相关。这些结果提示血清miR-133可能是一种有意义的早期诊断AMI的生物标记物，对于早期接受手术治疗挽救心肌有至关重要的意义。

3.3 miR-499 miR-499在肌肉中特异表达，在肌球蛋白基因调控中起重要作用。在AMI患者与小鼠AMI模型（冠状动脉结扎）血清中miR-133a、miR-1和miR-499-5p的水平均升高。从达峰时间上看，在AMI的典型症状胸痛已发生而肌酸磷酸激酶（CPK）和cT-nT的水平还未升高时，miR-1和miR-133a的水平已达峰值[12，14]；而miR-499-5p的峰值延迟至胸痛发生后6～I2h[12，15]。Li等[16]研究发现,与健康组相比，有 6个miRNAs（miR-1、miR-134、miR-186、miR-208、miR-223、miR-499）均在AMI患者血清中表达明显升高，且miR-208、miR-499在心绞痛中表达更高。上述结果均表明，miR-499也有作为生物标记物诊断冠心病的潜力。

3.4 miR-126和miR-155 miR-126是特异性的内皮细胞的miRNA，参与了内皮细胞的生物合成、血管发育等过程。Fichtlscherer等[17]通过基因生物芯片对8例冠心病患者和8例健康志愿者血清和血浆中miRNAs表达谱进行检测，发现在冠心病患者中miR-126表达水平显著降低；为了进一步验证这些结果，他们又利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测了31例冠心病患者和14例健康志愿者血清中的miR-126和miRNA-155水平，仍然发现这些miRNAs表达在冠心病患者中是显著降低的。Matsumoto等[18]调查研究发现，在AMI患者康复出院后1年内发生心脏死亡事件者血清中miR-155和miR-380的表达水平分别比健康者高4倍和3倍，这提示miRNAs不仅可以作为诊断疾病的标记物，还可以评估预后，血清miRNAs也许可以列入60岁以上患者入院常规检查项目，以筛查不典型AMI，降低病死率。

4 血清miRNA用于诊断冠心病的前景

血清miRNA用于冠心病诊断时具有的优势为：检测时损伤小、稳定性好、灵敏度高、检测方便、快捷等，而其缺点为血清中miRNA的含量较低，一般方法学不易检测。因此，寻找一种灵敏度高、操作简单且成本低廉的检测方法是血清miRNA应用于冠心病临床检测前需进一步解决的问题。解决的方法可能有以下几个方面：（1）选择合适的内参：内参的稳定性决定了检测结果的可靠性，以消除样品间RNA含量的差异。目前用于冠心病血清样本检测的内参最常用的有RNU6B和miR-16两种。（2）选用上调标记物：优先选择在冠心病中表达上调的血清miRNA，这样可提高检测的灵敏度和特异度。（3）多种标记物联合使用：仅仅采用一种血清miRNA作为冠心病标记物往往特异度不高，若将miRNA与其它类型冠心病标记物检测相结合，有望显著提高诊断的准确性。

总之，虽然相关研究尚处于起步阶段，然而miRNA最新的研究结果令人惊喜，miRNA具有很强的细胞、组织或疾病特异性，这些特异性表达既是其功能研究的基础，又是很好的疾病标记物。相信随着检测方法的成熟和研究的深入，血清miRNA会在冠心病的预测、诊断、预后评估、个体化治疗等方面拥有广阔的应用前景。

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2013-12-30）

（本文编辑：马雯娜）

浙江省自然科学基金（LY13H020009）；宁波市重大择优委托科技攻关项目（2011C51001）

315000 宁波大学附属李惠利医院心血管内科

周建庆，E-mail：hjmpin@163.com