遗传性抗凝血酶缺陷症基因突变的研究进展

李正民，宫璀催*，方盼盼，徐立博

(1.郑州大学第三附属医院 科研中心，河南 郑州450052；2.中国人民解放军第153中心医院济南军区检验中心;3.新乡医学院研究生院)

人体的抗凝系统主要有抗凝血酶(antithrombin,AT)系统(包括抗凝血酶和肝素，主要抑制具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，如：FXa，凝血酶等)和蛋白C系统(包括蛋白C,蛋白S,血栓调节蛋白,内皮细胞蛋白C受体等，主要灭活凝血因子Ⅴ和Ⅷ等)，而抗凝血酶系统中的抗凝血酶是人体最重要的抗凝因子之一，约占抗凝活性的70%。抗凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶(serpins)抑制剂，主要具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的凝血酶、FXa等因子，在人体抗凝系统中发挥着重要作用。

1 抗凝血酶的分子生物学特性

抗凝血酶也称为抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ),由Seegers,Johnson和Fell在1950年代进行的早期科学研究中发现，依次命名了四种AT(分别为ATⅠ、ATⅡ、ATⅢ、ATⅣ),但目前只发现ATⅢ有临床意义，通常用AT代指ATⅢ。

AT是一种由肝细胞合成分泌的糖蛋白，分子量为58KD，属于小分子蛋白。编码AT蛋白的基因全长14206 bp( GenBank: X68793.1)，位于染色体1q23-25，共有7个外显子(1、2、3a、3b、4、5、6)、6个内含子。

AT的蛋白结构较为复杂，由464个氨基酸(aa)组成，有9个a螺旋、3个β折叠(包括A、B、C)和一个反应中心环(RCL)，包含了3个二硫键和4种糖基化位点。三个单体内的六个氨基酸形成二硫键：Cys8- Cys128,Cys21- Cys95,Cys248- Cys430。四个潜在的N-糖基化位点位于人类抗凝血酶一级结构的96、135、155、192位置处的天冬酰胺氨基酸残基。在血浆中发现的AT主要形式是α-AT，它的4个糖基化位点各由1个共价低聚糖所占据附着，导致这种形式的AT分子量达到58200；次要形式是β-AT(约占10%左右)，它的4个糖基化位点中保留1个未被占据的135位处天冬酰胺糖基化位点,反应中心环中的P14、P15在β折叠结构A中展开的一种AT结构，是凝血酶的主要抑制物，对FXa的抑制能力比a-AT增加了300多倍。

AT在血浆中的半衰期约为72 h,在正常人血浆中的浓度约为0.12 mg/ml，即约为2.3 uM。抗凝血酶已经被从人类以外的物种中分离取得，经蛋白质分析和cDNA测序结果显示，牛、羊、兔和鼠的AT氨基酸链长度均为433个残基，比人类AT多1个氨基酸残基，这个额外的氨基酸残基出现在第六位的氨基酸残基位点上；牛、羊、兔、鼠与人类的AT基因序列相比，有84%-89%的一致性。

AT的主要功能是能够灭活凝血酶，抑制Xa因子以及Ⅸa、Ⅻa因子蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶，从而发挥抗凝血作用[1]。其次，AT能与肝素结合，使抗凝作用增加数千倍以上。此外，AT还具有抗炎症和抗血管新生的作用。有研究报道[2]:AT有两个重要的功能区，一个是位于羧基(C)端的反应位点,AT的反应位点在P1(Arg393)位和P1’(Ser394)位，P1通过与凝血酶活性中心的Ser结合，形成稳定的AT-凝血酶复合物，而灭活凝血酶;另一个是位于氨基(N)端的肝素结合区。据研究发现AT在血液中的浓度较低，此时AT的抗凝活性较小，但在有肝素分子存在的情况下，能够与肝素中的戊糖(pentasaccharide)序列结合，AT的构象发生改变，反应中心环(RCL)暴露，能够最有效的发挥抗凝作用[3]。

2 遗传性抗凝血酶缺陷症

遗传性抗凝血酶缺陷症是遗传性易栓症的一种，由Egeberg[4]于1965年首次报道，是由于编码抗凝血酶的基因发生突变所引起的一种常染色体显性遗传病，在人群中的发病率为万分之二到万分之五，中国人在静脉血栓栓塞症中的发病率为5.75%-7.14%[5]。遗传性抗凝血酶缺陷症主要临床表现为易反复形成静脉血栓，如肠系膜静脉、髂静脉、下肢深静脉等，最常见部位为下肢深静脉血栓，有些情况下也可在肺部形成血栓导致肺栓塞；少数动脉血栓可形成心肌梗死、甚至脑梗死。通常情况下，AT缺陷人群在AT基因发生突变的遗传性因素作用下，发生静脉血栓栓塞症的风险比正常人群增加了数倍，但AT基因发生突变的人群不会完全都形成遗传性AT缺陷症，遗传性AT缺陷症的发生也同时受到获得性诱因的影响，如手术、创伤、长时间制动、高龄、恶性肿瘤、口服避孕药、妊娠等，在遗传性基因突变和获得性诱因的双重作用下，遗传性AT缺陷症的发生率将显著增加。

遗传性AT缺陷症按照临床分型，可分为两型。Ⅰ型：是由于AT合成障碍，表现为AT含量的减少和AT活性的降低；Ⅱ型：是由于AT结构的异常，仅表现为AT活性的降低。Ⅱ型又根据AT蛋白变异缺陷部位的不同，分为三种亚型：Ⅱa型(又称ⅡRS型，反应位点变异)，是在AT与凝血酶的作用位点发生变异；Ⅱb型(又称ⅡHBS型，肝素结合位点变异)，是在AT与肝素的结合位点发生变异；Ⅱc型(又称ⅡPE型，多重变异)，为AT存在着多部位分子变异，呈多态性遗传缺陷。

遗传性AT缺陷症存在着纯合子突变和杂合子突变。AT纯合子突变的患者常常在出生时即可发病，常表现为多部位的、反复的发生动、静脉血栓栓塞症，甚至有时可危及患儿生命，存活率较低，需要长期使用抗凝药物治疗；杂合子突变的患者常在青少年期发病，有时在获得性诱因的作用下发病年龄可提前至儿童期，此型发生的静脉血栓栓塞症比纯合子型相对较轻，但因易反复发生，应定期监测凝血机制，可进行适当的预防性用药。

3 抗凝血酶的基因突变类型与功能

经检索相关文献报道以及查阅人类基因突变数据库(HGMD)[6]，截止至2012年12月，已发现269种引起遗传性抗凝血酶缺陷症的基因突变，突变形式包括点突变(错义突变、无义突变)151种、剪切位点突变19种、缺失69种、插入26种、重组突变4种。AT是主要的内源性抗凝血剂，这种蛋白的基因突变导致的分子功能障碍或缺陷，显著增加了血栓形成的风险。根据突变的位置不同(调节区或编码区)、血栓形成部位的不同，导致的临床症状有所不同，有些突变无明显临床症状，有些突变可形成特殊部位的血栓栓塞、出血等而危及生命。

3.1 点突变(错义突变、无义突变)

点突变(point mutation)是DNA多核苷酸链中单个碱基或碱基对的改变。在已知的AT基因突变中，点突变是最常见的突变形式，占已发现的AT基因突变的60%。点突变分为碱基替换和移码突变，发现的AT点突变主要是碱基替换(碱基替换中报道最多的是无义突变和错义突变)。据L.Hougardy等报道[7]，在进行肝移植的供体中，基因检测证实:供体的AT 2号外显子基因存在g.2586 C>T(p.Pro41Leu)碱基替换；在随后的遗传试验中，确诊为AT IIB型缺陷,是存在于AT肝素结合区的一个突变，导致AT与肝素的结合能力显著下降，不能发挥有效的抗凝作用。另据Picard V等报道[8],AT的Phe299Leu突变，导致合成了一种不耐热的复杂性AT蛋白，引起了AT功能缺陷。近年来，国内的顾怡等[9]报道了在同一家系中发现AT基因第2号外显子区存在两处点突变(错义突变)，分别是c.134G>A和c.342T>G,分别导致编码的AT蛋白Arg(CGG)被Gln(CAG)所替代(p.Arg13Gln)和Ser(AGT)被Arg(AGG)所取代(p.Ser82Arg)，这些突变分别导致了AT蛋白的表达障碍，分泌减少。

也有学者认为AT基因点突变引起的AT缺陷症，不完全是由于突变造成的蛋白表达异常，也存在着：AT蛋白能够正常表达，但在肝细胞内滞留，不能进入血浆，胞内浓度过高，形成AT生成的负反馈，从而造成分泌减少。Fitches AC等[10]报道了Ser82Asn引起的I型AT缺陷症，在进行深入表达研究后认为第82位氨基酸糖基化阻碍了AT翻译后的折叠、AT存在细胞内滞留，导致肝细胞分泌AT减少。Tanaka Y[11]等报道了C95R突变，导致CYS21-95间二硫键丢失，AT以寡糖形式聚集在内质网，AT分泌速度明显减慢。

据研究证实SERPINC1(AT基因符号)较低的突变(尤其是编码区)，对抗凝血酶表达水平的异质性影响较小，Dela Morenabarrio ME[12]等报道了AT基因的调节区突变(Ag.2143C>G),这种突变对外显子没有影响，仅对启动子略有影响，但其仍可以转录。而有些突变，可危及生命，据Kumar R[13]等报道了一对患有先天性AT缺乏症的新生儿兄妹(c.1009C>T;p.Q337X杂合突变)，发现存在有广泛的小儿脑静脉窦血栓形成(CSVT)以及脑实质和脑室内出血，危机患儿生命。

3.2 剪切位点突变

剪切位点突变是指酶切位点处的突变,该类突变发生率相对较少。Szymanska M等[14]报道了一种9788 G>A的剪切位点突变，在内含子4的5，端剪切位点第1个碱基处发现一个新的杂合突变(IVS4+1G>A),使得内含子4的剪切供体由G变为A。该病人伴多发性静脉血栓栓塞和缺血性中风、短暂性脑缺血，该突变对静脉血栓形成具有较高风险，这是首次对伴有复发性脑缺血的AT剪切位点突变的报道。

3.3 缺失和插入突变

缺失和插入突变是一种由于基因组DNA多核苷酸链中碱基对的插入或缺失，以致自插入或缺失点之后部分的或所有的三联体遗传密码子组合发生改变的基因突变形式，亦统称为移码突变。此种突变直接的分子遗传学效应是导致其所编码的蛋白质多肽链中的氨基酸组成种类和顺序的改变。目前，AT的7个外显子均发现有缺失的相关报道，有些为单一部位的碱基对的缺失，也有多部位缺失的报道。据报道：法国的两个家族中AT的外显子3A上分别出现小移码缺失，因此引起患者的AT基因缺乏翻译，AT分泌减少，导致两家族多成员发生血栓栓塞症[15]。关于多部位的缺失，有报道发现了AT基因组12个部位的缺失，这些缺失突变造成终止密码子的形成，转录提前停止，从而影响AT肝素结合位点和反应位点的形成，降低了AT活性[16]。

某些情况下，在DNA复制或损伤修复过程中，某一片段没有被正常复制或未能得到修复，导致形成片段缺失突变。Picard等[17]对22例疑似遗传性I型AT缺陷而基因测序结果无突变的患者，使用多重连接酶依赖性探针扩增法(MLPA)进行检测，发现其中10例为杂合子大片段缺失(5例为整个基因缺失；5例为部分缺失，包括外显子6缺失2例，外显子1-2缺失1例，外显子5-7缺失2例)。韩国学者[18]报道了一位27岁的韩国男性患者，AT杂合大跨越外显子1-6缺失，这种大片段缺失导致患者在17岁时左腿即出现红肿热痛等症状，18岁时发生了危及生命的肺栓塞、呼吸困难，后持续采用抗凝药物治疗。

3.4 重组突变

重组突变是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因重新组合的突变形式。近年来，AT的重组突变报道相对较少，但采用重组技术获得的新类型、新功能的AT却有不少报道。有报道[19]称发现了一种新类型的R47C和P41L嵌合体重组突变，肝素结合位点不能显露，导致抗凝血酶结合肝素能力缺陷。近年来，对于生产各种生物制剂的基因重组技术的应用日益广泛，有报道[20]称开发出了一种更安全的抗凝血酶变种，可作为肝素衍生物-磺达肝素钠的解毒剂。磺达肝素钠是一种人工合成的五糖类肝素衍生物，具有强大的抗凝作用，可作为肝素的替代品使用，但需要长期连续监测凝血机制，以免过量使用造成患者出血等不良反应。这种AT的变种(AT-N135QPro394)有两处突变,增加了对肝素及衍生物的亲和力(对磺达肝素钠的亲和力增加了3倍)，取消了抗凝血活性，据动物实验证明其可以有效抑制磺达肝素钠的作用，可以作为解毒剂使用。

4 小结

AT的基因突变可以导致AT蛋白的分泌障碍或使其在细胞内滞留而不能发挥抗凝血作用，可使AT的反应位点变异而降低抵抗凝血酶的活性，可使肝素结合位点变异而降低与肝素亲和力。作者查阅近年来国内外相关文献报道，发现遗传性抗凝血酶缺陷症的基因突变多为点突变；引起I型抗凝血酶缺陷症的基因突变大多为不同位点突变，引起II型抗凝血酶缺陷症的基因突变大多为重复位点突变；抗凝血酶缺陷症的基因突变大多数为杂合突变，报道的纯合子突变均为II型抗凝血酶缺陷症，病死率较高。在做AT基因突变研究时，也应注意基因多态性问题，可以查阅人类单核苷酸多态性(SNP)数据库，或应至少检测100份以上正常人的同一基因突变位点以排除基因突变的多态性。近年来，对于易栓症的综述报道较多，但对于遗传性AT缺陷症的综述报道较少，特别是对于AT基因突变的综述少有报道，本文对遗传性AT缺陷症的基因突变研究进展做一综述，对于以后的AT基因突变研究有一定的帮助作用。

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