西酞普兰对应激大鼠额叶皮质神经细胞PCNA、C-fos表达及凋亡的影响*

俞爱月，苏巧荣，王 岚，周 瑾，刘学红

（1.绍兴文理学院医学院心理教研室，2.实验中心，3.组织学与胚胎学教研室，浙江绍兴312000）

慢性应激可使大脑皮质神经细胞的形态结构和功能状态发生改变，也是抑郁障碍发生的重要因素之一［1］，据报道，这可能与神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的下调，原癌基因蛋白（protoogene protein，C-fos）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等表达水平改变有关［2］。而目前对于反映细胞增殖状况的可靠指标，即增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在慢性应激引起的额叶皮质神经细胞凋亡中的作用及其机制尚缺乏研究。据报道，文拉法辛、帕罗西汀等药物对慢性应激大鼠大脑神经细胞具有保护作用［3］。笔者的前期研究表明：慢性应激可通过影响大鼠额叶皮质神经细胞的Bcl-2、Bax表达水平，促进细胞凋亡；西酞普兰可调节慢性应激大鼠额叶皮质神经细胞的Bcl-2、Bax表达水平，拮抗细胞凋亡，产生保护作用［4］。在此基础上，本文对慢性应激大鼠额叶皮质神经细胞凋亡与PCNA、C-fos表达的关系进行研究，进一步阐明西酞普兰干预慢性应激引起的额叶皮质神经细胞凋亡的机制，从而为临床预防和治疗精神心理疾患提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠（购自于浙江中医药大学实验动物中心）24只，体重（238±21）g。

1.1.2 药物 氢溴酸西酞普兰：商品名为喜普妙（西安杨森制药有限公司生产）。

1.1.3 试剂 PCNA与C-fos免疫组化试剂盒、缺口末端标记法（TUNEL）所用试剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠饲养及动物模型的建立 按不同分组进行分箱饲养，每组8只，每箱4只，共6箱，允许其自由饮水进食。适应7 d后，开始实验。饲养环境为光、暗各 12 h，光照时间为 8∶00-20∶00，室内温度为（22.5±2.3）℃。对照组为空白组，无任何处理；西酞普兰＋慢性应激的实验组采取4 mg／kg·d西酞普兰灌胃；慢性应激组应用等体积生理盐水灌胃（我们的前期研究及相关学者也运用此分组方法）［5、6］。将后两组置于80 cm×40 cm×40 cm的水缸中，其水深 25 cm、水温（20.5±2.3）℃，每天强迫游泳 14～16 min，连续28 d建立慢性应激模型。

1.2.2 标本制备 造模成功后1 d，用2%戊巴比妥钠以60～70 mg／kg给予腹腔麻醉，开胸后经左心室快速灌注37℃生理盐水（含适量肝素）共（120±20）ml，然后灌注4%中性多聚甲醛溶液（采用磷酸盐缓冲液 PBS配制，pH 7.4，含 1／1 000的 DEPC）200～250 ml，30～40 min后取出鼠脑前额组织，并置于4%中性多聚甲醛溶液中固定。常规石蜡包埋，切片厚4～6μm。

1.2.3 免疫组化染色和细胞凋亡检测 免疫组化染色采用PV法，细胞凋亡检测采用缺口末端标记法。两者均要求切片常规脱蜡至水，然后进行微波修复5 min，再用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。PV法则是在上述基础上滴加Ⅰ抗（浓度1∶120），湿盒为37℃、60 min→滴加抗体 IgG（Fab段）→HRP多聚体，湿盒37℃20 min→DAB显色（以上各步间用PBS洗涤3次，每次5 min）→苏木精轻度复染，并脱水透明，然后用中性树胶封片，通过光镜观察。阳性细胞判别：细胞膜／细胞质可见棕色、黄色、淡黄色阳性颗粒，深浅不一；而细胞凋亡检测则加用试剂1和2混合液（1∶9）→湿盒 37℃ 60 min→滴加转化剂—POD 37℃、30 min→DAB显色→苏木精轻度复染，中性树胶封片，通过光镜观察。阳性凋亡细胞判别：呈圆形、椭圆形、月牙形或不规则形的核浓缩，颜色深浅不一，呈棕色或黄色。用已知阳性片做阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液做阴性对照。

1.2.4 电镜标本 首先固定标本，其次进行梯度脱水、包埋、切片、载网、染色（柠檬酸铅、醋酸铀），最后通过电镜进行观察。阳性细胞判别：细胞核皱缩，体积变小。早期核膜浓缩，核膜内分界不清，核仁浓缩；中期核膜变形呈不规则形或呈锯齿状，晚期核膜边界不清或核膜消失。

1.2.5 图像分析 运用日本尼康图像分析（NIS DR）软件，对额叶皮质神经细胞PCNA、C-fos蛋白表达，TUNEL阳性细胞数量进行统计。每只大鼠随机取切片2～3张，显微镜下分别选取2个视野（×400）

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计处理，所得结果均以（）形式表示，采用单因素方差分析进行比较。

2 结果

2.1 免疫组化法PCNA、C-fos蛋白表达光镜观察结果

阳性细胞胞核呈黄色或棕色、胞质不着色。应激组与对照组比较，可见少量PCNA表达阳性细胞、大量C-fos表达阳性细胞；而实验组与应激组比较，可见PCNA表达阳性细胞增多、C-fos表达阳性细胞较少（图1，表1，图1见彩图页Ⅱ）

2.2 额叶皮质神经细胞TUNEL法检测细胞凋亡情况

慢性应激组阳性细胞的体积比对照组小，细胞核发生浓缩的情况明显，形态上呈椭圆形、月牙形或不规则形，颜色呈棕黄色或黄色，亦可以看到大量凋亡小体；实验组可以发现少量阳性细胞，核浓缩现象较应激组明显减轻，染色也明显变淡（图2，见彩图页Ⅱ）。与应激组比较，对照组与实验组PCDA，C-fos阳性细胞数增加，TUNEL阳性细胞减少（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.3 额叶皮质神经细胞电镜观察结果

对照组大鼠额叶皮质神经细胞的细胞核大且圆，核膜完整，异染色质位于核膜下方，常染色质位于核仁周围，核仁位于核中央，结构正常。应激组皮质额叶可以看到较多的神经细胞核发生皱缩，体积也逐渐减小，核膜变形呈不规则形或呈锯齿状，晚期核膜边界不清或核膜消失。实验组大鼠细胞核皱缩的神经细胞数量，较应激组明显减少，小部分细胞核膜或核仁也有浓缩，但大部分神经细胞的细胞核大且圆，核膜完整，结构正常（图3）。

Tab.1 Changes of PCDA，C-fos and TUNEL positive cells in each group

Fig.3 Frontal cortex neurons in electron microscopy（×8 000）

3 讨论

强迫游泳是公认的建立抑郁应激模型的方法，在抑郁症的实验研究中应用广泛［7］。大鼠悬尾实验和力竭游泳实验均可客观地反映动物体能状态及“失望”情绪，是较为经典的反映大鼠心理抑郁程度的行为学评价方法［8］。我们的研究成功制造了慢性应激大鼠模型，间接提示西酞普兰能有效缓解心理抑郁、改善体力不足状态［9］。

PCNA是一种分子量为36 kD的蛋白质，存在于细胞核内，与细胞DNA合成关系密切，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。其阳性表达强弱代表细胞增殖活动的高低，是目前公认反映细胞增殖状况的可靠指标［10，11］。本实验结果显示，与对照组比较，应激组大鼠额叶皮质PCNA蛋白表达阳性细胞减少，提示慢性应激可诱导DNA损伤，抑制神经细胞的增殖；实验组大鼠额叶皮质PCNA蛋白表达高于应激组，这可能与保护性反应、增殖修复的调节功能激活有关，而这一功能的激活可能与适量使用西酞普兰有关，提示西酞普兰对神经细胞增殖具有激活作用。

至于不同剂量西酞普兰的作用结果，实验过程已设置低（1 mg／kg·d）、中（4 mg／kg·d）、高（8 mg／kg·d）三个不同剂量组，限于文章篇幅，选择典型中等剂量组进行比较，其余剂量组数据将另文发表。

C-fos是myc癌基因中的成员之一，其在细胞的分裂、信息传导调控等方面，起重要作用［12］。其在哺乳动物组织中表达率较高，而进化使其发生突变的几率偏低。在正常中枢神经系统某些部位，神经细胞可有基础水平的表达，但水平不高，急性应激可诱导C-fos发生快速、短暂高水平的表达［13］，而慢性应激可维持C-fos蛋白表达水平。另有研究提示，C-fos的高表达与凋亡反应的高表达密切相关，故能有效促使细胞特异性凋亡［14］。在人体内，C-fos蛋白与c-jun蛋白有亲缘性，共同组成异源二聚体。此合成物多与DNA结合，在诱导细胞凋亡方面，发挥至关重要的作用。从本次实验可以看出，应激组大鼠额叶皮质C-fos蛋白表达阳性细胞数明显高于空白对照组，与白云峰、王艳等对海马的研究结果基本一致［15］。其原因：慢性应激可能对大鼠额叶皮质导致了器质性损害，使其神经细胞功能降低，导致细胞表型改变。这与本实验中其余观测指标（即应激组大鼠行为的改变、PCNA下调、TUNEL阳性细胞增加）显示结果一致。提示C-fos一旦表达，可通过调控下游靶基因影响细胞内蛋白酶、受体、细胞因子等的表达，引起细胞代谢的紊乱，最后导致细胞表型改变或凋亡。而实验组大鼠额叶皮质C-fos蛋白表达低于应激组，提示西酞普兰可能通过对C-fos的调控拮抗细胞凋亡。

综上所述，本研究结果表明慢性应激可影响大鼠额叶皮质神经细胞PCNA、C-fos蛋白表达水平，从而促进细胞凋亡，也间接证实了西酞普兰可有效调控额叶皮质神经细胞PCNA、C-fos蛋白表达水平，拮抗细胞凋亡。

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