胶原诱导性关节炎小鼠CD4＋T细胞亚群表达酪氨酸羟化酶的作用*

王小琴，彭聿平，刘 展，邱一华

（南通大学医学院生理学系，江苏南通226001）

儿茶酚胺包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺，主要由神经细胞及内分泌细胞合成释放，除了可以调节机体的心血管、呼吸和消化功能外，还可以调节机体的免疫功能。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是儿茶酚胺合成的限速酶。本实验室以往的研究发现，T淋巴细胞可以表达 TH，并且能够合成释放儿茶酚胺。此外，T淋巴细胞来源的儿茶酚胺能够调节 T细胞的增殖、分化等［1-3］。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎和关节破坏、变形为主要特征的慢性自身免疫性疾病，其发病机制与CD4＋T细胞有着密切关系。CD4＋T细胞可以分为 T helper 1（Th1）、Th2、Th17和 regulatory T（Treg）细胞四个亚群。Th1细胞主要分泌致炎细胞因子 IFN-γ、IL-2等；Th2细胞主要分泌抗炎细胞因子 IL-10、IL-4等；Th17细胞分泌致炎细胞因子 IL-17、IL-22等；Treg细胞主要分泌抗炎细胞因子TGF-β等。Th1／Th2的功能失衡在 RA的发病过程起着非常重要的作用，Th17和 Treg细胞也参与了RA的发病过程［4］。胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）是最常见最可靠的 RA动物模型，它比较好地复制了人类的 RA疾病特点。本实验室最近的研究发现CIA小鼠滑膜组织中CD4＋T细胞表达的 TH增多［5］。那么在CIA的发生发展过程中，淋巴组织中的CD4＋T细胞亚群是否发生 TH表达的改变，且作用如何尚不十分清楚。据此，本研究利用CIA小鼠模型，观察CIA疾病过程中肠系膜淋巴结中CD4＋T细胞亚群表达TH的变化及作用，从而为CD4＋T细胞亚群来源的儿茶酚胺参与 RA的发病机制提供进一步的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性 DBA／1小鼠 36只，8～10周龄，平均体质量为 （18±2）g，随机分为对照组、35天模型组和55天模型组（n＝12）。小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，室内喂养一周后用于实验。

1.2 主要试剂

鸡 II型胶原（collagen II，CII）购于 Sigma公司；佛氏完全佐剂 （complete freund’s adjuvant，CFA）购于 Chondrex公司；脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）购于 Sigma公司；TH抗体购于 Millipore公司；IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4、IL-17、IL-22、TGF-β、T-bet、ROR-γt、GATA-3、Foxp3、β-actin抗体均购于 Santa cruz公司；莫能霉素 （monensin）、离子霉素 （ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇 （phorbolmyristic acetate，PMA）、FITC标记的抗 CD4抗体、APC标记的抗 IFN-γ、IL-17、IL-4、CD25抗体均购于BD公司。

1.3 CIA模型制备及模型成功判定标准

用 0.1 mol／L冰醋酸在冰浴中充分溶解 CII，使终质量浓度为 2 mg／ml，置于 4℃ 冰箱过夜后，与CFA等体积混合，充分乳化制成胶原乳剂。制备模型时，在小鼠尾根部多点皮内注射 0.1 ml胶原乳剂，初次免疫后第21天在腹腔注射该胶原乳剂0.1 ml激发免疫，第28天腹腔注射LPS20μg加速关节炎发生。关节炎分级评估：0分，所有的关节无任何红肿；1分，轻度的红和（或）肿；2分，显著的红肿；3分，关节僵硬或运动受限。每只小鼠所有关节均被评分，最高分为12分。

1.4 ELISA法检测血清中抗CII IgG抗体水平

初次免疫后第35天和55天，对小鼠进行麻醉、眼静脉取血，37℃ 静置 1 h，离心（3 000 r／min，15 min），取血清，-20℃保存。CII包被 96孔 ELISA培养板。根据文献［6］方法进行检测。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

在初次免疫后第35天和55天，取小鼠肠系膜淋巴结，加入组织裂解液 （100 mg／ml）匀浆，12 000 r／min离心 10 min，取上清，以 2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（BCA）法测定蛋白浓度。经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭 2 h后孵一抗（1∶200），4℃包被过夜，荧光标记羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）或荧光标记羊抗兔 IgG（1∶5 000）室温孵育1 h后 Odyssey双红外激光扫描系统扫描分析。

1.6 流式细胞术检测淋巴细胞表达TH的CD4＋T细胞亚群数目的变化

在初次免疫后第35天和55天，分离小鼠肠系膜淋巴结中的淋巴细胞，以1×107cells／ml的密度加入12孔板，同时每孔加入 PMA（50 ng／ml）、离子霉素 1μmol／L和莫能霉素 2μmol／L，37℃ 、5%CO2孵育5 h，收集细胞，进行细胞表面CD4分子、CD25分子、胞内 IFN-γ、IL-17和 IL-4因子及 TH抗体染色，利用 BD公司 FACS Array流式细胞仪进行检测。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 DBA／1小鼠注射胶原乳剂后的临床评分和血清中抗CII IgG抗体水平的变化

小鼠经 CII免疫后第31天开始，相继出现明显的RA症状，小鼠表现为萎靡、饮食及运动减少、舔足且踝关节出现明显炎性红肿，在发病早期（初次免疫后第35天）和发病晚期（初次免疫后第 55天）临床评分均升高。CIA小鼠血清中抗 CII IgG抗体的水平明显高于对照组，且发病晚期与发病早期相比明显降低，两者之间有显著性差异（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Clinical score and anti-CIIIgGlevel in serum in CIA mice（，n＝8）

Tab.1 Clinical score and anti-CIIIgGlevel in serum in CIA mice（，n＝8）

CIA：Collagen-induced arthritis**P＜0.01 vs intact；＃＃P＜0.01 vs CIA（day 35）

Group Clinical score Anti-CII IgGlevel Intact 0 0.22±0.14 CIA（day 35） 8.75±1.75 3.89±0.16**CIA（day 55） 8±1.15 3.47±0.19**＃＃

2.2 CIA小鼠肠系膜淋巴结中致炎细胞因子和抗炎细胞因子表达的变化

CIA小鼠肠系膜淋巴结中致炎细胞因子 IFN-γ、IL-2、IL-17和 IL-22的表达较对照组明显增加。其中IL-17的表达在发病晚期较发病早期明显下降，但仍显著高于对照组。IFN-γ、IL-2和 IL-22的表达在发病早期和发病晚期之间差异无统计学意义（图1）。CIA小鼠肠系膜淋巴结中抗炎细胞因子 IL-4、IL-10和 TGF-β的表达均显著低于对照组，但在发病早期和发病晚期两个时间点之间没有显著性差异（图 1）。

Fig.1 Expression of proinflammatory and antiinflammatory cytokines in mesenteric lymph nodes of CIA mice（，n＝3）

2.3 CIA小鼠肠系膜淋巴结中 Th1、Th17、Th2和Treg细胞的特异性转录因子表达的变化

CIA小鼠肠系膜淋巴结中Th1细胞的特异性转录因子T-bet和Th17细胞的特异性转录因子 ROR-γt的表达与对照组比较均明显增加，在发病早期和晚期两个时间点之间差异均无统计学意义（图2）。在CIA小鼠的发病早期和发病晚期，肠系膜淋巴结中Th2细胞的特异性转录因子GATA-3和Treg细胞的特异性转录因子Foxp3的表达与对照组相比均没有显著性差异（图2）。

2.4 CIA小鼠肠系膜淋巴结中TH表达的变化

此外，我们检测了CIA小鼠肠系膜淋巴结中TH表达的变化。结果显示，与对照组相比，CIA小鼠肠系膜淋巴结中 TH的表达显著增加，在发病早期和发病晚期两个时间点之间无显著性差异（图3）。

Fig.2 Expression of Th1-，Th17-，Th2-and Treg-related transcription factors in mesenteric lymph nodes of CIA mice（，n＝3）

2.5 CIA小鼠肠系膜淋巴结中表达TH的CD4＋T细胞亚群的数目的变化

为了说明在CIA发生发展过程中 CD4＋T细胞亚群即 Th1、Th17、Th2和 Treg细胞是否表达 TH，且变化如何，我们分离出小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞，用流式细胞术检测了 CD4＋T细胞中各亚群以及表达 TH的 CD4＋T细胞各亚群的数目的变化。CD4＋T细胞中 IFN-γ＋细胞代表 Th1细胞，IL-17＋细胞代表 Th17细胞，IL-4＋细胞代表 Th2细胞，CD25＋细胞代表Treg细胞。首先，与对照组相比，CIA小鼠的CD4＋T细胞中 TH＋的细胞数显著增加，在发病早期和发病晚期之间无显著性差异（表2）。其次，CIA小鼠的 Th1和 Th17细胞的数目以及表达 TH的Th1和Th17细胞的数目与对照组相比均显著升高，且发病晚期与发病早期相比有所下降（表2）。此外，Th2细胞的数目在发病早期显著降低，而在发病晚期与对照组相比无显著性差异。CIA小鼠的Treg细胞的数目与对照组相比均无显著性差异。CIA小鼠的表达TH的Th2和Treg的数目与对照组相比无显著性差异（表2）。

Tab.2 Changes of number of TH-expressing CD4＋T cell subsets in mesenteric lymph nodes of CIA mice，n＝4）

Tab.2 Changes of number of TH-expressing CD4＋T cell subsets in mesenteric lymph nodes of CIA mice，n＝4）

CIA：Collagen-induced arthritis*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact； ＃＃P＜0.01 vs CIA（day 35）

Cell number（%） Intact CIA（day 35） CIA（day 55）TH＋cells 29.38±4.30 37.96±5.81**35.04±1.73**IFN-γ＋cells 55.58±2.20 68.15±3.79**60.38±2.5*＃＃IFN-γ＋TH＋cells 26.28±2.79 36.98±1.98**30.53±1.72*＃＃IL-17＋cells 8.85±0.79 19.48±2.41**14.88±1.58**＃＃IL-17＋TH＋cells 2.38±0.48 7.23±0.75**4.58±0.51**＃＃IL-4＋cells 27.25±1.60 24.1±1.40**25.35±1.39 IL-4＋TH＋cells 10.20±1.17 10.30±0.98 10.20±0.77 CD25＋cells 9.63±0.79 9.55±1.15 9.18±1.01 CD25＋TH＋cells 3.33±0.37 3.90±0.78 3.70±0.51

3 讨论

从CIA发病过程中的临床表现可以看出小鼠关节显著的炎症反应。有研究报道，机体对 CII的免疫反应与 CIA的发生有关［6］。本实验中我们发现，在初次免疫后第35天 和 55天，CIA小鼠血清中抗CII IgG抗体的水平明显高于对照组，且初次免疫后第55天的抗体水平与初次免疫后第35天相比明显降低。本实验室先前的研究发现，在 CIA的发生发展过程中，先出现剧烈的急性炎症反应，而后随着时间的推移，逐渐出现关节内的骨质损伤反应［5］。提示，初次免疫后第35天（发病早期）是一个急性炎症期，而初次免疫后第55天（发病晚期）则处于慢性反应期。

本研究中我们发现 CIA小鼠肠系膜淋巴结中Th1和Th17细胞分泌的致炎细胞因子的表达均显著增加，Th2和Treg细胞分泌的抗炎细胞因子的表达均显著减少。这些结果说明在 CIA的发生过程存在着致炎细胞因子／抗炎细胞因子的失衡，而且在疾病晚期，致炎细胞因子／抗炎细胞因子的失衡有所缓和。另外，CIA小鼠肠系膜淋巴结中 Th1和 Th17细胞的特异性转录因子的表达增加，CD4＋T细胞中Th1和Th17细胞的数目与对照组相比均显著升高。Th2和Treg细胞的特异性转录因子的表达没有变化，CD4＋T细胞中 Th2细胞的数目显著降低，Treg细胞的数目与对照组相比无显著性改变，说明 CIA的发病过程中还存在着Th1／Th2和 Th17／Treg细胞比例的失衡。这些结果说明，CD4＋T细胞各亚群Th1、Th17、Th2和 Treg细胞均参与了炎症的发生发展过程，主要表现为Th1和Th17细胞的致炎反应增强和Th2和Treg细胞的抗炎反应减弱，提示在 CIA发病过程中，肠系膜淋巴结中存在 Th1／Th2和Th17／Treg细胞免疫反应的失衡。此外，在疾病的后期 Th1／Th2和 Th17／Treg细胞免疫反应趋向平衡。

CIA小鼠的炎症组织中能产生儿茶酚胺的细胞是多样的，如巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞均被发现能够产生儿茶酚胺［7］。既往研究表明，CIA小鼠的淋巴组织中 TH＋或 VMAT-2＋细胞数显著高于对照组［8］。本实验室最近的研究表明，在 CIA小鼠的关节滑膜中的CD4＋T细胞可以表达 TH，且表达增多［5］。本研究的结果显示 CIA小鼠肠系膜淋巴结中TH的表达也增多。流式细胞术的结果显示CD4＋T细胞中 TH＋细胞数目显著增多，提示 CIA小鼠肠系膜淋巴结中增多的儿茶酚胺有部分来自于CD4＋T细胞。通过进一步的研究发现，CD4＋T细胞中表达TH的Th1和 Th17细胞的数目与对照组相比显著升高，而表达TH的 Th2和 Treg细胞的数目与对照组相比无显著改变，提示这种儿茶酚胺的增多主要来源于 Th1和 Th17细胞的作用。在 RA中，Th1和Th17细胞来源的儿茶酚胺的作用及意义是复杂的。在 CIA的发病晚期，Th1和Th17细胞产生的儿茶酚胺比发病早期有所减少，这与发病晚期致炎细胞因子／抗炎细胞因子的失衡有所缓和并相平行，提示Th1和Th17细胞来源的儿茶酚胺可能有抑制炎症反应的作用。有研究报道，儿茶酚胺可以抑制 Th1细胞的细胞因子 IFN-γ和 IL-2的产生，而增加 Th2细胞的细胞因子 IL-10和 IL-4的产生［9］。过继转移TH＋细胞可缓解 CIA的症状，CIA小鼠关节内注射利血平（囊泡单胺转运体-2的阻断剂，可增加细胞内的儿茶酚胺），其局部炎症也可得到缓和［10］。提示在 CIA发病过程中，Th1和 Th17细胞产生的儿茶酚胺有可能通过调节机体致炎细胞因子／抗炎细胞因子的平衡，从而使局部炎症得到缓和，但具体的作用机制还需要通过深入的实验来阐明。

综上所述，CIA小鼠临床评分和血清中抗 CII IgG抗体水平升高，发病过程中肠系膜淋巴结中Th1和Th17细胞的致炎反应增强以及Th2和Treg细胞的抗炎反应减弱。CIA小鼠肠系膜淋巴结中 CD4＋T细胞表达TH增多，这种增多主要来自于 Th1和Th17细胞的作用。发病晚期 Th1和Th17细胞表达的TH有所减少，与 CIA炎症的缓和相平行，提示Th1和Th17细胞产生的儿茶酚胺能发挥抗炎效应，缓和局部炎症。

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