PCR-电喷雾电离质谱技术诊断人工关节感染*

张超凡 汤一苇 林建华 张文明

（1.福建医科大学附属第一医院骨科，福建福州 350004；2.纪念斯隆-凯特琳癌症中心检验医学系与内科学系，美国纽约）

PCR-电喷雾电离质谱技术诊断人工关节感染*

张超凡 汤一苇 林建华 张文明

（1.福建医科大学附属第一医院骨科，福建福州 350004；2.纪念斯隆-凯特琳癌症中心检验医学系与内科学系，美国纽约）

人 工 关 节 感 染（prosthetic joint infection,PJI）是关节置换术后严重的并发症，在初次人工关节置换术后的发生率为1%～2%，在人工关节翻修术后的发生率为 1%～10%[1]。虽然 PJI的总体发生率不高，但随着人工关节置换术数量的增加，PJI的病例也将逐渐增多。PJI的诊断困难、治疗方法复杂、疗效不确切，部分患者可发生关节功能的永久丧失，给社会和家庭带来巨大负担。

国际上现有多种PJI的诊断标准，如美国肌肉骨骼 感 染 协 会（MSIS）标 准[2]、美 国 骨 科 医 师 协 会（AAOS）标准[3]以及 2013 年 8 月最新于美国 费 城 制订的假体周围感染的国际共识[4]。PJI的诊断综合了患者的临床表现、关节液白细胞计数、关节液或假体周围组织细菌培养、术中冰冻切片、血清学检查（如ESR、CRP等），其中假体周围组织或关节液的细菌培养阳性是诊断PJI的“黄金标准”。据文献报道，传统细菌培养方法的敏感性为 50%～65%[5,6]，临床上还有很多诊断为 PJI但细菌培养阴性的病例[6,7]。另外，PJI的细菌培养方法还有一些不足之处，如部分患者术前取材困难、培养时间较长（2 周或更长）[4]，且有一定的假阳性率[7]。

近年来，微生物分子诊断技术如多聚酶链反应技术（polymerase chain reaction,PCR）、荧光原位杂交技 术（flurorescent in situ hybridization,FISH）等 开 始应用于 PJI的研究，以PCR技术应用最多。PCR方法多 样 ，如 针 对 微 生 物 16S rRNA 的 广 谱 PCR、多 重PCR、逆转录 PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）等，可通过设计特殊引物扩增病原体核酸片段，以检测扩增产物，从而鉴定微生物[8]。传统 PCR 技术检测时间短，可获得比细菌培养更高的敏感性，逐渐成为无菌体液感染诊断的“铂金标准”，但PCR也存在假阳性率偏高、无法获取待测微生物耐药基因、操作复杂 等 缺点[5,9-11]。因 此，一 种将 PCR 与质 谱（mass spectrometry,MS）相 结 合 的 新 型 微 生 物 分 子 诊 断 方 法PCR-MS 也开始逐渐应用于PJI诊断的研究，而其中尤以 PCR-电喷雾电离（electrospray ionization,ESI）质谱技术（PCR-ESI/MS）应用最为广泛。

1 PCR-ESI/MS技术

MS技术作为一种分析手段已有数十年的历史。一台质谱仪主要由离子源、质量分析器和离子检测器三部分组成，其基本原理是使待测样品在离子源中发生电离，生成不同质荷比的带电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束进入质量分析器。质量分析器按不同质荷比分离不同质量的离子，分离后的离子依次进入离子检测器，经信号放大、计算机处理，最终绘制成质谱图，并与已有的数据库比对进行样品种类的鉴定[12]。

根据离子源的不同，用于微生物检测的MS技术主要包括 ESI/MS 与基质辅助激光解吸电离-飞行时间 - 质 谱（matrix assisted laser desorption ionisationtime of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）两种。ESI/MS 和上游 PCR 放大耦联成为 PCR-ESI/MS技术，主要通过扩增微生物核酸片段、测定扩增产物的碱基序列检测病原体。而MALDI-TOF-MS技术则通过检测病原体的蛋白萃取物直接识别微生物[13]。有文 献报道 ，PCR-ESI/MS 技术 与 MALDI-TOF-MS 技术在微生物的鉴定能力上并无明显区别[14]；也有文献认为，MALDI-TOF-MS 技术需要预先进行细菌分离，检测时间长；对细菌菌落形成单位（colony-forming units,CFU）低于 104～105的标本，MALDI-TOF-MS 技术无法检出，也无法检测多重细菌感染和细菌的抗药基因[15]。相比之下，PCR-ESI/MS 技术的优势较为明显，目前在PJI诊断中的应用也最多。

传统 PCR 技 术单独用于 PJI的微生物检测仍存在诸多缺点：首先，由于使用通用引物扩增微生物核酸片段，PCR技术容易受污染细菌影响，检测的假阳性率偏高，其中某些广谱PCR方法还需加做后续的基因测序，操作复杂、费时费力；其次，目前大部分PCR方法仅能检测样本中的单种病原体，无法检测出多重感染；再次，对于临床治疗至关重要的微生物药敏结果，传统 PCR 技术也无法测出[5,16]。

与传统 PCR 技术不同，PCR-ESI/MS 技术的使用多对严格设计的通用性及种属特异性引物扩增病原体DNA的特定区域。引物设计方式的改良不仅减少了污染菌的检出机会，还减少了所需的样本量。此外，PCR-ESI/MS 质谱仪从标本制备完成到最后得出试验结果仅需 6 h，且全程自动化，明显提高了检测效率；而其读数方便，最后结果还包含了置信区间，让研究者对最后结果的解读也更具科学性[17]。

2005 年首次报道 PCR-ESI/MS 技术应用于感染性疾病的诊断[18,19]，2008 年以来，其在微生物检测、流行病调查、环境监测等领域均有应用[13]。Kevin 等[20]将其用于血培养瓶阳性标本的病原体鉴定，可将检出的微生物精确到“种”水平，此技术平台有望直接应用于全血标本成为快速诊断菌血症的全新手段[21,22]。在一项纳入近千份标本的前瞻性对照研究中，该技术的灵敏度是常规血培养的两倍，而检测时间则缩短至 1 d 以内。进一步临床资料分析结果提示，绝大多数标本血培养阴性，该技术阳性的患者为临床败血症[23]。Ecker等[24]则将该技术用于进一步分析微生物的基因型。除细菌病原体外，该技术还用于检测鉴定病毒[25,26]、疟原虫[27]和真菌病原体[28-31]。在自然界，PCR-ESI/MS 技术还可检测多种植物和水生环境中的病原体[32,33]。目前，使用 PCR-ESI/MS 技术不仅可检测超过3400种细菌和40多种真菌、病毒，还可检测病原体的抗生素耐药基因，如 vanA、vanB、blaKPC、mecA等，以指导临床抗生素使用；此外，对于复杂的多重细菌感染，PCR-ESI/MS 技术也可快速检出[34]。

2 PCR-ESI/MS技术在PJI 诊断中的应用

2.1 PCR-ESI/MS 的检测灵敏性与特异性

Ibis T5000 质谱仪与 PLEX-ID 质谱仪是现有 PJI的研究报道中应用最多的仪器，Ibis T5000 质谱仪最初由美国 Ibis生物科学公司研制，雅培公司于 2009年将 Ibis公司收购，并将 Ibis T5000 升级为 PLEX-ID系统。

一个新诊断方法的敏感性与特异性是临床医师最 关注 的问 题 。 Jacovides等[35]分 别 使 用 Ibis T5000质谱仪与传统细菌培养方法对临床诊断为 PJI的 23例患者的术中关节液标本进行病原菌检测，最终Ibis T5000 检测阳性 22 例，传统细菌培养检测阳性 18例，其中17例通过两种方法检出了相同的细菌，显示了很好的一致性；Ibis T5000 检测在传统细菌培养阴性的5例中检出细菌4例，显示了更高的敏感性。Rasouli等[16]的 一 项类似研究使用 Ibis T5000 质 谱 仪检测了65例全膝关节翻修术中的关节液，术前诊断为PJI的 21 例患者中的 Ibis T5000 检测阳性 19 例，而细菌培养方法仅 10例（阳性率不足 50%），同样提示Ibis T5000 检测有更高的敏感性。Greenwood-Quaintance等[36]的最近一项研究分别使用 PLEX-ID 质谱仪与传统细菌培养对431份髋、膝关节翻修术中取出的假体经超声波裂解、离心的液体进行检测，其中152例患者术前诊断为 PJI，279 例为无菌性松动（aseptic failure,AF）。152 例中 118 例经 PLEX-ID 检测到细菌DNA（敏感性为 77.6%，特异性为 93.5%）；而传统细菌 培 养 阳 性 106 例（敏 感 性 为 69.7% ，特异 性 为99.3%），两者的敏感性与特异性均有统计学差别。PLEX-ID 检测阳性的 118 例标本中 85 例检出的细菌与传统细菌培养检出的细菌完全一致，17例细菌培养阴性，10例传统细菌培养还得到额外的细菌，4例PLEX-ID 检出额外细菌，而另有 2 例用两种方法检出完全不同的细菌。在106例细菌培养阳性的标本中5例并未被 PLEX-ID 检出。Greenwood-Quaintance等[36]的研究还发现，35 例术前 14 d 内使用抗生素治疗的PJI患者的标本中PLEX-ID 检测的敏感性为85.7%，传统细菌培养的敏感性仅为 65.7%（P=0.0196）；61 例术前 28 d 内使用抗生素治疗的PJI患者的标本中 PLEXID 检测的 敏感 性为 85.7%，高于传 统细 菌培 养 的73.8%（P=0.0348），说明 PJI患者关节翻修手术前使用抗生素治疗对细菌培养的影响较大，对 PCR-ESI/MS技术的影响小，反映了PLEX-ID 检测较强的微生物检测能力。

术前诊断为人工关节AF而行翻修手术的患者中 ，Jacovides 等[35]使 用 Ibis T5000 质 谱仪 检 测 57 例AF 患者的关节液标本，其中50例检出细菌DNA（阳性率为88%），而传统细菌培养只有1例标本阳性（阳性率为 1.8%）；Rasouli等[16]使用同样的仪器与方法，44 例 AF 患者的 Ibis T5000 检测阳性 17 例（阳性率为38%），其中2例在一期翻修术后早期即出现了感染，其余15例短期随访（12～26个月）未出现感染征象；Greenwood-Quaintance 等[36]使 用 PLEX-ID 质 谱仪 检测了279例AF患者翻修术中取出的假体经超声裂解后的液体，发现细菌 DNA 阳性 18 例（阳性率为6.5%），但18 例阳性标本中 14例无法用其他检测方法（包括细菌培养、16SrRNA PCR 测序和 PCR 芯片技术）加以证实；9例检测出水/土壤的细菌（其中7例经最后鉴定是PCR处理过程污染或试剂污染）；3例能用其他分子诊断方法（16SrRNA PCR 测序和 PCR 芯片技术）检测出同一种基因型细菌，但细菌培养阴性；1 例 PLEX-ID 检测出细菌 DNA，但其他方法检测出不同基因型的细菌。

上述 3 个研究中 Ibis T5000/PLEX-ID 在 AF 患者中的检测阳性率差别很大，Greenwood-Quaintance等[36]认为标本的处理、仪器软件及硬件的差别可能是主要原因：在他们的研究中，PLEX-ID 检测的是经过超声裂解和震荡离心法处理过的标本；PLEX-ID 是为临床应用而设计，使用更为完善的软硬件系统和更严格的分析标准，而 Ibis T5000 是较早的仪器，其硬件和软件都不如 PLEX-ID，且没有分析标准和阈值设定（cut off），其检测准确性较差。

微生物分子检测结果的判读要比传统细菌培养复杂得多，一个阳性的分子检测结果的真正含义仅是在一个临床标本中找到了该微生物特异的核苷酸片段，但这可以是微生物污染（Contamination）、定植（Colonization）或感染（Infection），因而其临床意义最终 仍 需 结 合 患 者 的 临 床 资 料 进 一 步 明 确[37]。 Jacovides等[35]的研究应用 Ibis T5000 检测了 7 例初次进行人工关节置换患者的关节液，最终有5例检测阳性，其中有4例还同时检出了3种细菌。他们在后续的研究中还继续使用FISH等微生物检测方法进行辅助验证，结果显示这5例接受初次关节置换的患者关节腔中的确有和 Ibis T5000 检测结果一致的微生物存在。然而，作者对于如何解释这一结果仍无定论，并开 展 更 多 大 样 本 的 研 究 ，是 Ibis T5000 检 测 技 术 的“高灵敏度”导致的假阳性，还是检测过程的污染仍需进一步研究。

2.2 PCR-ESI/MS 检测多重感染与耐药基因

PCR/ESI-MS 技术 在 多重细菌 感 染的检测 上 也具优势。Stoodley 等[17]在 1 例全踝关节置换术后临床考虑感染，但术前关节腔穿刺培养阴性的患者中使用 Ibis T5000 检测假体周围组织标本，最终同时检出了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）和表皮葡萄球菌，而传统细菌培养方法仅检出MRSA，并进一步使用FISH等分子诊断方法验证上述结果的准确性，减少检测假阳性的可能。Gallo 等[38]也在 1 例临床考虑感染但细菌培养阴性的全髋置换术后患者中用 Ibis T5000 检测假体周围组织标本，最终不仅检出MRSA，还检出高载量的蜡样芽孢杆菌，而该例患者术前还使用了抗生素治疗，提示了 Ibis T5000 良好 的检测敏感性。但 Stoodley 等[17]和 Gallo 等[38]的研究均只纳入了 1 名患者，样本量太小，有一定的局限性。

PCR/ESI-MS 技 术 同样可检测 待测微生物 的 耐药基因。Stoodley 等[17]、Jacovides等[35]和 Gallo 等[38]的研究中均使用 Ibis T5000 检出与传统细菌培养方法检 出 的 MRSA 相 对 应 的 mecA 耐 药 基 因 ；Greenwood-Quaintance 等[36]的 152 例 PJI标 本 中 ，PLEX-ID在 10 例标本中检出了 mecA 基因，而这 10 份标本传统的细菌培养并未检出MRSA菌。准确判别样本是否为多重细菌感染并进一步获取微生物的药敏信息对于 PJI的治疗意义重大，PCR/ESI-MS 技术在这方面显示了很好的检测潜力，但仍有待更多研究进一步证实。

综上，PJI的诊断一直是关节外科和微生物检验领域的难点，寻找快速、准确的微生物检测技术对于PJI的诊断至关重要。PCR-ESI/MS 技术具有敏感性高、可检测多重微生物感染和微生物的耐药基因、检测时间短、操作便捷等优点，为 PJI的诊断提供了新的思路。但 PCR-ESI/MS 技术也有一些缺点，如假阳性率高、仪器及耗材昂贵等。PCR-ESI/MS 技术能否成为临床微生物室的常规工作，仍需进一步研究。

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福建省科技厅国际合作重点课题（2013I0002）；福建省临床重点专科建设项目

**通信作者：张文明，E-mail:zhangwm0591@163.com