电针对缺血性脑卒中再灌注损害大鼠CREB表达的影响

杨珊莉江一静陶 静陈立典

（1福建中医药大学附属康复医院，福州，350001；2福建中医药大学，福州，350108）

电针对缺血性脑卒中再灌注损害大鼠CREB表达的影响

杨珊莉1江一静2陶 静1陈立典2

（1福建中医药大学附属康复医院，福州，350001；2福建中医药大学，福州，350108）

目的：探寻电针对缺血性脑卒中再灌注损害大鼠cAMP反应原件结合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）表达的影响。方法：将60只健康成年的SD大鼠驯养3 d随机分成假手术组、模型组以及电针组，每组各20只，使用线栓法大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）对模型组、电针组大鼠进行脑缺血模型制作，缺血2 h后进行再灌注，电针组大鼠接受电针干预，再灌注3 d后将大鼠断头取脑，进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色以及图像软件分析观察脑梗死体积，免疫蛋白印迹法（Western blotting）检测CREB蛋白水平，聚合酶链反应（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，PCR）检测CREB的基因表达水平。结果：TTC及其图像软件分析表明，电针组的SD大鼠脑梗死面积明显小于模型组（P＜0.01）；电针组的SD大鼠CREB蛋白水平明显高于模型组（P＜0.01）；电针组的SD大鼠CREB基因水平明显高于模型组（P＜0.01）。结论：电针改善脑缺血再灌注损伤可以通过上调CREB实现。

脑缺血；再灌注损伤；电针；cAMP反应原件结合蛋白

脑卒中是一组突然起病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高等特点，是当今严重威胁人类健康与生命的主要疾病，2004年世界卫生组织报告[1]指出全球每年约有1 500万新发脑卒中患者，约500万患者发病后死亡。2011年“世界卒中日”最新调查结果显示，我国脑卒中的发病率以每年9%的速度上升，已经成为我国国民第一位死亡原因，死亡率高于欧美国家4～5倍[2]。脑卒中中最常见的是缺血性脑卒中，其发病率占脑卒中的85%以上，常造成人类中枢神经系统大量神经细胞缺失和神经网络受损，导致患者长期神经功能障碍[3]。缺血所导致的组织受损是临床上死亡的主要原因之一。在缺血性疾病的急救过程中临床工作者逐渐发现，缺血本身对组织造成的损害远远低于恢复血供后过量的自由基攻击缺血组织细胞所造成的“组织缺血再灌注损伤”。缺血性组织恢复血供后活性氧自由基水平上调，组织经过缺血后合成抗氧化酶能力下降，过氧化物被转换为无害的物质的过程障碍，导致过氧化物在体内堆积而加剧了对缺血后再灌注组织的损伤。目前治疗脑卒中后肢体功能障碍的方法多种多样，其中电针疗法在治疗缺血性脑血管病已被认为是行之有效的方法之一，且不存在血脑屏障的问题。但其具体机制仍处于不断的探索中。本课题立足于探索电针改善缺血性脑卒中肢体运动状态的机理，以丰富中医针刺治疗脑卒中的理论基础，为同类研究提供可靠的理论依据。笔者通过对60只成年SD进行造模干预观察，探寻电针对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机理，报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物及其分组 60只健康成年清洁级SD大鼠，体重220～280 g，平均（250±30）g，鼠龄2.5～4个月，平均（2±0.2）月。大鼠全由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。60只大鼠随机分成假手术组、模型组、电针组，每组各20只，3组大鼠在体重、鼠龄等一般情况方面无统计学差异，具有可比性。

1.2 模型制作 参照改良的Zea Longa[4]方法制备大鼠MCAO模型。首先使用10%水合氯醛按照0.3 m L／kg的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，随之将处于麻醉状态的大鼠固定于手术台，剔除大鼠颈部皮毛，与颈部正中切开长约3 cm的切口，将左侧颈总动脉（Common Carotid Arteries，CCA）充分暴露，逐步剥离迷走神经，将颈外动脉（External Carotid Artery，ECA）和颈内动脉（Internal Carotid Artery，ICA）充分剥离暴露，将CCA远心端充分结扎，用动脉夹夹闭ICA近分叉口处，同时将ECA近分叉口处充分结扎，在CCA近动脉分叉用显微剪剪切一小口，用硅化鱼线（d＝0.26 mm，鱼线的2.0 mm及2.5 mm处各用记号笔作标记）插入切口。松掉ICA的血管夹后鱼线缓慢向颈内动脉插入，可见第一个标记距动脉分叉约2 mm时停止，用缝合线将CCA和鱼线栓紧，缝好后用酒精棉球消毒皮肤缝合处。2 h后将鱼线拔出2 cm长度，形成再灌注模型。假手术组大鼠只切开皮肤剥离颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉后即缝合皮肤，缝好后用酒精棉球消毒皮肤缝合处。

1.3 治疗方法 3组SD大鼠置于相同环境饲养，假手术组、模型组大鼠造模成功后第1天，开始模拟捉拿、电针，用直径40 mm华佗针牌针具点触穴位，每日1次，连续治疗3 d；电针组参照李忠仁主编的《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位取穴，对大鼠右侧合谷、外关、阳陵泉、足三里进行针刺，针刺深度上肢4～6 mm，下肢6～8 mm，连接刺激电极后对大鼠进行疏密波（疏波／密波＝10 Hz，Hz／5 s，10 s）的刺激，以大鼠针刺肢体出现节律的收缩、颤动为度，持续30min，每日1次，连续治疗3 d。

1.4 标本采集 治疗结束后，按指标检测要求取材，具体操作如下：0.3 mL／kg的10%水合氯醛剂量腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉完全后腹正中线切开腹腔，分离出腹主动脉后以采血针+真空管采集腹主动脉血液，随即冰盐水灌注取脑。

1.5 神经行为学评价 参照Zealonga神经损害评分标准[5]：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分。向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。1～3分说明造模成功。

1.6 脑梗死体积计算 使用TTC染色法检测大鼠脑梗死的面积。各组大鼠断头取脑后将脑组织置于-20℃冰箱冷冻15 min至脑组织变硬，用锋利刀片将大脑自大脑半球额极至枕极做连续冠状位切片，每片厚约2 mm，切成6片。将脑片放入1%TTC磷酸缓冲液（PH＝7.4）后用锡箔纸盖住后，置于37℃温箱10～15 min，用毛笔不时翻动脑片，使脑片均匀接触到染色液。TTC与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故脑梗死组织呈苍白色。利用ImageProPlus 6.0分析软件对脑梗死面积进行计算，然后得出脑梗死体积（梗死体积＝梗死面积和×2 mm）。

1.7 Western-blotting法测定蛋白水平变化 将所取大脑皮质200 mg，加入1 mL裂解液，4℃进行匀浆，15 000 r／min离心后取上清液，取25 mL上清液进行BCA法测定浓度并计算上样量。将上清液和上样缓冲液按照4∶1比例混匀后置于100℃的金属浴中变性7 min。电泳（6%浓缩胶，12%分离胶，60V 145 min）结束后将凝胶取出，进行转印（100V 2 h）之后将PVDF膜取出，用丽春红对PVDF膜上的蛋白质进行预染，以证实蛋白质确实转移到膜上。使用TBST配置而成的5%脱脂奶粉进行封闭2 h，TBST洗3次，每次10 min，分别加入相应抗体，4℃环境孵育过夜后TBST洗3次，每次5 min，再用碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（1∶1 000）室温1 h，TBST洗3次，每次5 min。将PVDF膜放入显影仪器平板中，滴入ECL化学显影剂反应1 min后显影，计算机扫描，数据处理。

1.8 rtPCR法测定基因水平变化 根据NCBI中Genebank基因库的设计引物序列，扩增片段长度约100～300 bp。用0.1%DEPC水过夜室温或37℃处理1.5 mL Eppendorf管和取液用10μL，200μL和1 mL Tip，高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。将300 mg大鼠大脑皮质组织加入4.5 m LTrizol提取液于冰上快速研磨后置于离心机中以12 000 r／min速度离心后取上清液，将上清液吸于另一新离心管后加入1 mL氯仿，用力震荡15 s，冰上放置5 min，再12 000 r／min，4℃离心15 min，将上清液吸于另一新离心管后加入3 mL异丙醇后均匀混合，冰上放置15 min，12 000 r／min，4℃离心15 min后弃上清液，加入1 mL 75%乙醇轻轻摇晃，再7 500 r／min，4℃离心5 min后将乙醇液弃去，冰上静置10 min后加入DEPC-H2O溶解总RNA后进行逆转录。逆转录过程：95℃（6 min）→55℃（90 s）→72℃（90 s）→72℃（10 min）→5℃（1 h）。Real-Time PCR操作方法按照试剂盒说明书，使用GAPDH作为内部参照，将GAPDH的拷贝数作为校正基数，通过ABI7500软件获得检测指标Ct（cycle threshold）值，与同样本中GAPDH的Ct值相减，即获得该样本中相应指标的ΔCt值。以假手术组ΔCt值作为校正，软件根据2-ΔΔCT数值计算得出检测指标基因浓度水平。

1.9 统计学处理 采用SPSS 18.0对所得数据进行统计分析，组间显著性比较采用t检验；计数资料以百分率表示，组间显著性比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 电针对大鼠脑梗死面积的影响 电针组的SD大鼠脑梗死面积明显小于模型组（P＜0.01），见表1。

表1 各组梗死体积变化比较（m2）

2.2 电针对大鼠CREB蛋白水平的影响 电针组的SD大鼠CREB蛋白水平明显高于模型组（P＜0.01），见图1。

图1 各组CREBWestern-blotting结果比较

2.3 电针对大鼠CREB基因水平的影响 电针组的SD大鼠CREB基因水平明显高于模型组（P＜0.01），见表2。

表2 CREB基因变化比较（±s，光密度）

表2 CREB基因变化比较（±s，光密度）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，△△P＜0.01。

组别CT（CREB）CT（GAPDH）2-△△CT假手术组23.99±1.49 20.90±1.23 1模型组28.04±1.28 22.89±1.55 0.23±0.77△△电针组26.63±0.83 22.46±0.83 0.48±0.44*

3 讨论

CREB是一种聚在脑细胞的分子，作用在于刺激特定基因，制造蛋白质，强化细胞彼此的连接。通过激活CREB实现启动细胞内一系列信号转导通路来促进神经元存的目的。CREB属于cAMP结合元件依赖蛋白，脑缺血疾病发生后蛋白激酶与ATP结合催化成cAMP的过程受抑制，机体cAMP浓度由此下降，因而抑制了CREB的激活，不利于改善神经元的内生长状态，影响神经元轴突再生[5-7]。有研究表明脑缺血后及早增强的磷酸化CREB，可阻止脑缺血半影区梗死灶的扩大，同时体外研究发现磷酸化CREB在介导神经元对各种神经营养素，如BDNF和NGF的反应方面起重要作用。另外，CREB还可调节多种基因的表达，参与脑缺血损伤的内源性保护机制[8-15]。

本课题实验结果显示，脑缺血再灌注损伤大鼠经过电针干预后脑梗死面积明显缩小，CREB的表达水平明显升高，说明电针干预可通过上调CREB的表达水平减少脑缺血再灌注损伤影响的程度，从而病情恢复，提示电针对脑缺血大鼠的神经细胞保护机制之一，可能是通过上调CREB的表达而实现的。

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（2013-02-12收稿 责任编辑：徐晖）

The Im pact of Electro-Acupuncture on the Expression of CREB in Ischemia-Reperfusion Rats

Yang Shanli1，Jiang Yijing2，Tao Jing1，Chen Lidian2
（1 Rehabilitation Hospital affiliated to Fujiang University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，350001，China；2 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，350108，China）

Objective：To explore the impact of electro-acupuncture on the expression of CREB in the ischemia-reperfusion rats.Methods：Sixty healthy adult SD rats which were domesticated for 3 days were randomly divided into the shame group，the model group and the electro-acupuncture group.There were 20 rats in each group.The rats of the model group and the electro-acupuncture group were given the line bolt method（MCAO）to complete the brain ischemia model，and were reperfused 2 hours after ischemia.The electro-acupuncture group adopted the intervention of electro-acupuncture.Three days after the reperfusion，all the rats were beheaded and taken brains.The cerebral infarction volume was observed through TTC staining and image analysis，and the protein expression of CREB were detected by protein imprinting method（Western blotting）and gene expression of CREB were tested by Real-Time PCR.Results：TTC and the image analysis showed that the cerebral infarction volume of electro-acupuncture group was significantly smaller than that of the model group（P＜0.01）；the CREB protein level in the electro-acupuncture group was obviously higher than that of the model group（P＜0.01）；the CREB gene level in the electro-acupuncture group was much higher than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Electro-acupuncture can realize the improvement of the cerebral ischemia reperfusion injury by up-regulating CREB.

Cerebral ischemia；Reperfusion injury；Electro-acupuncture；CREB

R245.9；R255.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.027

教育部博士点基金博导类（编号：20103519110001）；青年科学基金项目（编号：81102628）

陈立典，男，研究生，教授，校长，脑血管疾病的康复，E-mail：lidianchen87＠yahoo.com