黄芩苷对人肺腺癌LTEP-A2细胞的抑制作用及机制研究

韦小白董竞成

（1复旦大学附属华山医院静安分院，上海，200040；2复旦大学附属华山医院，上海，200040）

黄芩苷对人肺腺癌LTEP-A2细胞的抑制作用及机制研究

韦小白1董竞成2

（1复旦大学附属华山医院静安分院，上海，200040；2复旦大学附属华山医院，上海，200040）

目的：研究观察黄芩苷对人肺腺癌LTEP-A2细胞株体外的抑制作用及相关机制。方法：采用不同浓度的黄芩苷干预人肺腺癌LTEP-A2细胞株，用CCK-8方法检测不同时间点不同浓度的黄芩苷对肺癌细胞增殖的抑制程度，接着用细胞划痕试验和Transwell小室侵袭试验观察黄芩苷对肺癌细胞体外迁移、侵袭能力的影响；用Western blot进一步检测黄芩苷干预后肺癌细胞MMP-2、MMP-9、TGF-β的表达的变化。结果：黄芩苷能明显抑制肺癌细胞增殖；能不同程度降低肺癌细胞的迁移、侵袭、体外划痕愈合能力，呈浓度依赖性；黄芩苷能不同程度下调MMP-2、MMP-9表达，其中以高浓度效果明显，中浓度居中，低浓度作用稍弱，与空白对照组比较，组间差异有统计学意义，P＜0.05；对肺癌细胞TGF-β的表达没有显著影响，与对照组比较，P＞0.05。结论：黄芩苷能不同程度地降低肺癌增殖迁移侵袭的能力，其机制可能是通过下调MMP-2、MMP-9的表达从而对肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭发挥抑制作用。

黄芩苷；增值；迁移；LTEP-A2细胞；MMP-2；MMP-9

黄芩苷（Baicalin）是从唇形科植物黄芩中提取、分离出来的黄酮类化合物，是黄芩的主要有效成分之一，具有多种药理作用，如：抗菌、抗氧化、诱导干细胞分化等[1-3]。近年来，随着对黄芩苷的深入研究，发现黄芩苷还能够抑制黏液表皮样癌肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤作用[4]。目前，对黄芩苷抗肿瘤作用的实验研究主要集中在人前列腺癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌和恶性黑色素瘤等恶性肿瘤[5-6]，但是关于黄芩苷作用于肺癌细胞株的研究较少，如仅有少量报道黄芩提取物能够诱导SPC-A-1细胞凋亡，其机制可能与黄芩提取物能上调caspase -3表达和下调survivin基因表达有关[7]。既然黄芩苷对肺癌细胞株SPC-A-1有作用，那么对肺癌细胞株LTEP-A2又有着怎样的作用？除了诱导细胞凋亡，黄芩苷是否还可通过其他途径发挥作用，目前仍不是十分清楚。为了进一步明确黄芩苷的抗肿瘤作用，本研究观察其对LTEP-A2细胞增殖、迁移、侵袭的影响，并进行相关分子机制的初步探讨，以期为临床应用黄芩苷治疗肺癌提供科学的理论依据。

1 材料和方法

人肺癌细胞株LTEP-A2购自中国科学院上海细胞生物研究所。药物黄芩苷购自南京青泽医药公司，纯度：99.1%。小牛血清、RPMI1640培养液购自Gibco公司；CCK8试剂购自日本同仁化学研究所；β-actin抗体为Santa Cruz公司产品；MMP-2、MMP-9、TGF-β抗体为Cell signaling technology公司产品；HRP标记羊抗兔二抗为北京康为世纪生物科技有限公司产品。实验共分为4组，分别为50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黄芩苷组，空白对照组加等量0.5%二甲基亚砜（DMSO）。

1.1 CCK-8法 取对数生长期细胞按1×105／mL接种于96孔板内，设3个复孔，加入不同浓度黄芩苷，总体积100μL，培养24、48、72、96 h后，每孔加入CCK -8溶液10μL，继续培养2 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（A），计算细胞增殖抑制率，绘制细胞增殖抑制曲线。增殖抑制率计算公式：增殖抑制率（%）＝（A对照组-A实验组）／A对照组×100%。

1.2 Transwell小室侵袭试验 采用24孔板Transwell小室进行，包被有胶原基质的Matrigel滤膜孔径为8 μm。分别将50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黄芩苷处理的肺腺癌LTEP-A2细胞株用0.25%胰蛋白酶消化后，以105个／孔接种于上层小室，下层小室加入10%胎牛血清（FBS）培养液，37℃孵育24 h，取出滤膜，用棉拭子轻轻擦掉滤膜上层的细胞，将滤膜用PBS淋洗，固定、染色（参照细胞迁移实验相关步骤），置于甲醇固定10 min，高倍镜下随机选取5个视野，计数迁移至滤膜下层的细胞，实验重复3次。抑制率（%）＝（实验组侵袭细胞的数量／对照组侵袭细胞的数量）× 100%。

1.3 Transwell小室细胞迁移试验 将Fibronectin 200倍稀释至终浓度50μg／mL，在Transwell小室内加入100μL，小室外加入400μL，4℃过夜。准备受试细胞悬液：取对数生长期细胞，吸取细胞培养液，无钙磷的PBS液冲洗，胰蛋白酶消化细胞，用含1%FBS细胞培养液收集和重悬细胞，调整细胞密度为1×105／mL。吸取transwell中Fibronectin，PBS冲洗一次。将Transwell小室放入24孔培养板中，在小室外加入400μL含10%FBS完全培养液，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育6 h，PBS漂洗3次，4%PAF固定30 min，PBS漂洗3次，Cooomassieblue室温染色适当时间。倒置显微镜下1×10物镜计数贴附于小室多孔膜上的总细胞数（No），棉签擦去小室多孔膜上方细胞，计数残留在小室多孔膜下方的细胞数（N1）。按以下公式计算细胞迁移率：细胞迁移率＝N1／No×100%。每孔计数5个视野。

1.4 细胞划痕试验 将肺腺癌LTEP-A2细胞株传代于玻片上，生长至100%汇合后，用无菌吸头在玻片上划痕。磷酸盐缓冲液（PBS）洗净被刮下的细胞，每孔加纤连蛋白后分别加入50μmol／L、100μmol／L、200 μmol／L黄芩苷，对照组加等量0.5%二甲基亚砜（DMSO），孵育96 h，取出玻片，低倍视野下观察细胞伤口愈合情况。随机选取5个视野，计数迁移细胞的数量，以此表示细胞的迁移活性。实验平行重复3次。计算：细胞迁移抑制率（%）＝（实验组迁移细胞数／对照组迁移细胞数）×100%。

1.5 MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白表达的Westernblot检测 收集50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L黄芩苷处理96 h的LTEP-A2细胞及对照组细胞，用PBS洗涤，加入5倍体积含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰浴20 min，12 000 r／min离心15 min，弃去沉淀，上清液为细胞总蛋白。用Bradford法测定蛋白含量。100℃变性10 min，每孔加等量的蛋白样品进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜上，5%牛奶室温封闭1 h。分别加入兔抗人MMP-2、MMP-9、TGF-β抗体，4℃孵育过夜。以TBS漂洗5 min×3次，加入羊抗兔HRP标记二抗，室温孵育1 h后TBS漂洗5 min×3次，用化学发光法检测后分析结果。

1.6 统计学处理 实验数据用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。计量资料用（±s）表示，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞体外增殖的影响（*提示P＜0.05）

2 结果

2.1 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞增殖抑制作用

CCK-8方法检测黄芩苷对LTEP-A2细胞增殖的影响，结果发现不同浓度的黄芩苷对肺癌细胞有着不同程度的抑制作用，其中高浓度组（200μmol／L）的抑制作用最明显，中浓度组（100μmol／L）的抑制作用居中，低浓度组（50μmol／L）次之。随着时间的推移，不同浓度的黄芩苷作用于肺癌细胞24 h后开始显示出抑制作用，48 h后作用显著，96 h后达到高峰，与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05（如图1）。

2.2 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞迁移作用的影响 将不同浓度的黄芩苷预处理96 h后进行划痕实验、transwell小室迁移实验。结果如图2所示：三种不同浓度的黄芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌细胞的体外愈合能力，其中高浓度组（200μmol／L）的抑制作用最明显，中浓度组（100μmol／L）的抑制作用居中，低浓度组（50μmol／L）次之，与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05（如图2、图3）。

图2 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞体外划痕试验的影响

图3 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞体外划痕试验影响统计图（*P＜0.05）

2.3 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞侵袭作用的影响 将不同浓度的黄芩苷预处理96 h后进行Transwell小室侵袭实验。结果如图所示：三种不同浓度的黄芩苷能不同程度降低LTEP-A2肺癌细胞的侵袭能力，其中以其中高浓度组（200μmol／L）的抑制作用最明显，中浓度组（100μmol／L）的抑制作用居中，低浓度组（50μmol／L）次之，与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05（如图4）。

2.4 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞MMP-2、MMP -9、TGF-β蛋白表达的影响 将不同浓度的黄芩苷预处理96 h后进行Westernblot检测。结果表明：三种不同浓度的黄芩苷能不同程度的下调LTEP-A2肺癌细胞MMP-2、MMP-9表达，其中以其中高浓度组（200μmol／L）的抑制作用最明显，中浓度组（100 μmol／L）的抑制作用居中，低浓度组（50μmol／L）稍弱，与对照组比较，差异有统计学意义，P＜0.05。而黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞TGF-β蛋白表达没有影响，与对照组比较，P＞0.05（如图5、图6）。

图4 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞迁移侵袭能力的影响

图5 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞MMP-2，MMP-9的影响

图6 黄芩苷对肺腺癌LTEP-A2细胞TGF-β的影响

3 讨论

肺腺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在我国，肺腺癌死亡居恶性肿瘤首位[8]。由于肺腺癌细胞具有快速侵袭、迁移的特征，因此它是肺癌预后最差的病理类型之一[9-10]。因此，如何有效抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，是改善预后、控制病情进展的关键。

黄芩性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒等功效。主治壮热烦渴，肺热咳嗽，黄疸，目赤肿痛，胎动不安，痈肿疗疮等。关于黄芩可治肿瘤的功效，早在《神农本草经》就载黄芩具有“主诸热黄疸，肠癖泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”的功效。而黄芩苷为传统中药黄芩的主要有效成分之一，目前研究发现黄芩苷对多种肿瘤均有较好的作用。如王英俊等[6]用不同浓度的黄芩苷处理结肠癌细胞株SW-1116后，发现50，100，200μmol／L黄芩苷能够诱导结肠癌细胞株SW-1116凋亡，凋亡率与剂量呈正相关，并随药物浓度和作用时间而变化。细胞周期分布呈现G1期比例逐渐增高，出现典型的凋亡峰。说明黄芩苷能诱导结肠癌细胞凋亡，并明显抑制癌细胞增殖，具有抗肿瘤作用。现有研究表明黄芩苷可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用，如抑制肿瘤新生血管生成从而降低肿瘤细胞的增值迁移[11]，如通过降低环氧化酶-2的表达抑制前列腺素E2的产生，进而阻断前列腺素合成酶对肿瘤细胞的促进作用[12]。而关于黄芩苷对于肺癌细胞迁移、侵袭能力的作用及机制研究，目前缺乏相关报道。本研究结果显示，黄芩苷对LTEPA2细胞增殖具有明显的抑制作用。同时，经过黄芩苷的干预后，肺癌细胞的侵袭、迁移能力与对照组比较都有不同程度的降低。且这种抑制作用具有时间和剂量依赖性，这和已有报道黄芩苷能抑制人肝癌细胞的侵袭能力[13]一致。

基质金属蛋白酶（MMPs）对基底膜中细胞外基质的降解是肿瘤浸润和转移的重要步骤之一[14-15]。MMPs家族是一类内源性蛋白水解酶，MMP-2和MMP-9是该家族的重要成员，这两种酶的主要功能为降解明胶和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜胶原，在细胞与基质间的黏附中起着重要的作用，MMP-2、MMP-9的表达与肿瘤侵袭关系密切。有研究显示，在肺癌细胞中，MMP-2、MMP-9高表达可促进该肿瘤的浸润、转移[16]。

TGF-β在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中均有表达，是预测相关肿瘤的易感性及肿瘤预后的重要细胞因子[17-21]。有研究表明，TGF-β可促进前列腺癌的侵袭转移[11]。既然MMPs和TGF -β在肺癌的转移复发中如此重要，而黄芩苷能显著抑制肺癌细胞的迁移、侵袭，那么用黄芩苷干预后这些细胞因子是否也发生改变？本实验研究发现，与对照组比较，黄芩苷组的MMP-2、MMP-9的表达下降，TGF-β表达不变。为了进一步验证黄芩苷与MMP-2、MMP-9与TGF-β的关系，我们分别用不同浓度的黄芩苷干预肺癌细胞，结果发现高浓度的黄芩苷组MMP-2、MMP-9表达最低，低浓度组较高浓度组表达高，中浓度组居中，而不同浓度的黄芩苷对TGF-β表达没有影响。

总之，本研究发现黄芩苷能不同程度地降低肺癌增殖迁移侵袭的能力，其机制可能是通过下调MMP-2、MMP-9的表达从而对肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭发挥抑制作用。

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（2013-10-10收稿 责任编辑：王明）

Study on Inhibition Effect and Mechanism of Baicalin on LTEP-A2 Cells in Lung Cancer Patients

Wei Xiaobai1，Dong Jingcheng2
（1 Jingan Branch of Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China；2 Huashan Hospital affiliated to Fudan University，Shanghai200040，China）

Objective：To explore the inhibition effects and mechanism of baicalin on LTEP-A2 cells in vitro of lung cancer patients.Methods：Human pneumonicadenocarcinoma cell line LTEP-A2 was cultured with different dose of baicalin for different periods of time. Cell proliferation was assayed by using Cell Counting Kit-8，and further in vitro study including tumor cell migration and invasion，wound healing assays were performed.Besides，MMP-2，MMP-9，TGF-β，which were related to the migration and metastasis potential in lung cancer cell lines were detected by western blot.Results：Baicalin inhibited the proliferation of LTEP-A2 cells in a time and concentrationdependent manner.In tumor cell migration and invasion test，wound healing assays etc.showed significantly decreased migration，invasion in baicalin-treated cell groups vs control tumor cells.Further study showed that MMPs decreased after baicalin-treated.The higher doses of baicalin，the lower level of MMP-2／MMP-9.However，baicalin did not have a significant effect on the TGF-β.Conclusion：Baicalin inhibits the proliferation and migration of lung cancer LTEP-A2 cells，possibly by decreasing the expression of MMP-2，MMP-9 in part.

Baicalin；Proliferation；Metastasis；LTEP-A2 cells；MMP-2；MMP-9

R285.5；R734.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.025

董竞成（1959—），男，博士，博士生导师，教授，复旦大学附属华山医院中西医结合研究所，E-mail：jcdong2004＠126.com

韦小白（1981—），女，博士，复旦大学附属华山医院静安分院，E-mail：weixiaobai2005＠163.com