纤维素降解细菌的筛选及其产酶条件研究

■王 蕾 李贤宇

（天津渤海职业技术学院，天津300402）

植物纤维素是植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富、最廉价而又可再生的资源。目前，我国饲料原料资源短缺，因此，开发利用纤维素资源对我国养殖业发展具有重要的意义。即使能够利用纤维素的反刍动物也因内源酶不足极大地降低了饲料的消化率及利用率。因此，高效的纤维素酶的开发成为植物纤维用于饲料的关键。

纤维素酶作为一种安全、高效的生物催化剂已广泛应用到饲料、食品、纺织、生物能源开发等行业，有着非常广阔的应用前景。但是饲料工业中纤维素酶还存在一系列问题，如菌株产量低、生产成本高、酶活力下降迅速等。同时，目前纤维素酶生产菌株多为真菌，相对于细菌来说，存在诸多缺点。因此，本研究从牛瘤胃中筛选出纤维素分解菌，旨在为有效处理高纤维素类物质提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

牛瘤胃内容物采自泰安市三合水厂附近养牛场。

1.1.2 培养基

富集培养基：微晶纤维素5.0 g、NaNO31.0 g、Na2HPO4·12H2O 0.65 g、KH2PO40.9 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪蛋白 0.5 g，蒸馏水1 000 ml，pH值自然，121℃灭菌20 min。

羧甲基纤维素钠刚果红培养基：CMC-Na 10 g、酵母膏1.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂15 g、刚果红0.2 g、土豆 10 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然，121 ℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉浸膏3.0 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 5.0 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：CMC-Na 10 g、胰蛋白胨5 g、酵母膏1 g、蒸馏水1 000 ml，pH值7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离筛选

菌种的富集培养：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的羧甲基纤维素钠刚果红培养基之前，先通过选择培养富集纤维素分解菌，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。对取来的牛瘤胃内容物进行预处理，将其研磨成小颗粒，取1 g加入到50 ml富集培养基中，28℃恒温培养5 d，适时振荡。取富集培养液作分离筛选实验。

菌种的分离筛选：取1 ml富集培养液进行梯度稀释，挑选合适浓度在羧甲基纤维素纳刚果红平板上进行平板涂布，28℃恒温培养3 d。在众多不同形态菌落中挑取能够产生水解圈的菌382株。将挑选菌株点接于羧甲基纤维素纳刚果红平板，28℃恒温培养3 d后，根据水解圈大小进行初步筛选。测定CMC相对酶活，平板划线分离单菌落，观察记录菌落形态，接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，进行菌种保藏。

1.2.2 酶活力的测定

CMC相对酶活的测定：测量点接于羧甲基纤维素钠刚果红培养基上的菌株水解圈直径，计算CMC酶相对酶活。CMC相对酶活A（cm/d）=水解圈直径（cm）/培养时间（d）。

CMC酶活力的测定：采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS）测定酶解液中还原糖含量。将各菌分别接种于发酵培养基，28℃培养3 d。取2 ml发酵液和2 ml 0.5%CMC-Na溶液加入比色管，振荡均匀，50℃水浴加热30 min。取出后，在每个比色管中加入1.5 ml DNS试剂，沸水浴5 min,立即冷却，并定容至25 ml。520 nm处测其光密度值，对比标准曲线，计算酶活力。在该条件下，1 ml发酵液在30 min内催化生产1 mg还原糖称为1个酶活力单位。

计算公式表示如下：

酶活力单位(U)=1 mg葡萄糖/(1 ml发酵液·30 min)。

1.2.3 培养条件对产酶的影响

培养温度为28℃，转速160 r/min、pH值自然，研究不同发酵时间对产酶的影响；培养温度为28℃，转速160 r/min，培养时间64 h，研究不同pH值对产酶的影响；pH值6.0，转速160 r/min，培养时间64 h，研究不同温度对产酶的影响；培养温度为28℃，pH值6.0，培养时间64 h，研究不同转速对产酶的影响。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选

2.1.1 纤维素降解菌的初筛

将经富集培养挑选的菌株点接于羧甲基纤维素纳刚果红平板，28℃恒温培养5 d后，根据水解圈大小进行初步筛选，选择相对酶活较高的菌株，结果见表1。

表1 相对酶活力值（28℃5 d）

通过观察羧甲基纤维素钠刚果红平板各菌落发现，C1、C2、C6、C8、C9、C10、C11菌株逆光观察菌落周围有正圆形水解圈，但颜色较浅，C5菌株有明显水解圈，边缘明确，培养基表面下凹。这一结果和表1中各菌落水解圈直径及相对酶活一致。

2.1.2 纤维素降解菌复筛

对初筛获得8株菌株进行摇瓶复筛，结果见表2。

由表2可以看出，在相同条件培养下，C5号菌酶活力较其它菌株最强。

2.1.3 C5菌株的初步鉴定

将筛选到的C5菌株培养3 d，菌落成圆形、乳白色不透明、低突起、表面湿润、边缘光滑。细胞呈短杆状，有芽孢，菌株为革兰氏阳性菌（见图1），经穿刺培养表明为需氧或兼性厌氧菌，因此，该菌株为芽孢杆菌属菌株。

2.2 培养条件对产酶的影响

图1 C5菌株革兰氏染色效果

2.2.1 培养时间对产酶的影响

培养温度为28℃，转速160 r/min、pH值自然，分别在12、20、28、36、44、52、60、68、76、84 h进行酶活测定，结果见图2。

图2 培养时间对产酶的影响

由图2可以看出，随着发酵时间延长，纤维素酶活力逐渐提高，64 h达到最大值，之后随着发酵时间的延长，纤维素酶活力略微下降。

2.2.2 发酵液初始pH值对产酶的影响

设定初始pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，培养温度为28℃，转速160 r/min，培养时间64 h后测定其酶活，结果见图3。

图3 初始pH值对产酶的影响

由图3可以看出，在28℃恒温且其它条件都相同的情况下培养64 h，纤维素酶活随着pH值升高呈现先升高后下降的趋势，pH值为6.0时，CMC酶活力达到最大，说明C5菌生长适宜中性偏酸环境。

2.2.3 培养温度对产酶的影响

pH值6.0，转速160 r/min，分别在16、20、24、28、32、36℃下培养64 h，测定其酶活变化，结果见图4。

由图4可以看出，温度对微生物产酶有着重要的影响，在16～28℃温度范围内，随着温度升高，C5菌产酶能力逐渐提高，然后随着温度升高，产酶能力呈现下降趋势。因此，C5菌最适产酶温度为28℃。

2.2.4 转速对产酶的影响

转速分别设定120、140、160、180、200、220、240 r/min,培养温度为28℃，pH值6.0，培养时间64 h后测定酶活，结果见图5。

图4 培养温度对产酶的影响

图5 转速对产酶的影响

由图5可知，转速对C5产酶能力有着一定影响，低转速及高转速对产酶均不利。当转速达到180 r/min时，酶活力最高。

3 结论

从牛瘤胃内容物中经富集培养、初筛、复筛获得纤维素酶相对较高的菌株C5，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属菌株。经发酵试验证明，菌株C5在28℃生长较好，产酶的最适初始培养基pH值为6.0，最佳摇床转速为180 r/min，发酵64 h后，酶活力达到最高峰，该菌株在生产中具有一定的应用前景。

（参考文献10篇，刊略，需者可函索）