血管内皮生长因子抑制剂及在放疗中的作用的相关研究进展*

张 姣 综述，高春玲审校

(中国人民解放军第174医院放疗科，福建厦门361003)

肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily TNFSF)由一组结构相近的细胞因子组成，通过与细胞表面的特异性受体结合发挥强大的生物学功能，在机体免疫应答、炎症反应中发挥重要的作用，并对细胞的增殖、分化、凋亡起到调控作用［1］。VEGI是肿瘤坏死因子超家族中的一员，又称为TNFSF15(tumor necrosis factor superfamily-15)［2］，也可以称为 TL1(TNF like ligand-1)或是 TL1A［3］。VEGI与家族中其他成员一样，为多功能性细胞因子，VEGI主要由血管内皮细胞和树突状细胞分泌，发挥抑制内皮细胞生长的功能［2，4］。

1 VEGI的发现

VEGI最初发现时因有特异性血管内皮细胞生长抑制作用，故得此名［2］。同时，在人类脐静脉内皮细胞cDNA库中也发现了VEGI，并因与TNF-α的氨基酸序列有高度的相近性，又称为TL1(TNF like ligand-1)［5］。VEGI的一级结构与人 TNF-α、TNF-β及Fas配体的一级结构存在20%～30%的同源性，后又被人类基因图谱工程命名为TNFSF15［6］。

2 VEGI的结构及分布

VEGI基因定位于人染色体9q32，分子量约为17kb，含有4个外显子，3个内含子，外显子与内含子之间的连结严格遵从GT-AG规律。经选择性剪接产生3种不同的VEGI蛋白同源异构体，其中既有胞内型，也有分泌型，分别是 VEGI-174、VEGI-251和VEGI-192［7］。其中最早被报道的 VEGI亚型含有174个氨基酸残基，即VEGI-174。另外两种异构体分别含有251和192个氨基酸残基，即VEGI-251和 VEGI-192，分别由分子量为 1．5kb、7．5kb 和 2．0kb 的基因片段编码而来［7-8］。VEGI蛋白的氨基末端结构各不相同，羧基末端均由151个氨基酸残基构成，且三种亚型中这151个氨基酸序列相同。其中VGI-251是含量最多的亚型，可以在细胞培养液中检测到，如血管内皮细胞、VEGI-251转染的哺乳动物细胞。VEGI-174被认为是一种细胞膜结合性分泌蛋白，单次跨膜将一段短的N端胞浆区域与C端的胞外结构域分隔开来。C端第29～174位的氨基酸残基，组成具有抗血管生成活性的功能结构域。而VEGI-192呈低表达状态，发现较晚，Chew［7］等最先发现，并证实rhVEGI-192对血管生成的抑制作用是抗血管生成药物重组内皮抑素(endostatin)的20倍。

目前已有VEGI晶体结构的相关报道［9-10］。和TNF家族其他成员的三级结构一样，VEGI的三级结构由三个VEGI单体聚集而成，每个单体含有两个 β-环，形成“三明治”样结构［10］。VEGI的功能性受体叫做DR3(death receptor 3)，是TNF受体超家族成员之一，VEGI通过激活DR3发挥调节免疫和刺激树突细胞成熟等作用［11］。而DcR3(decoy receptor 3)是DR3的天然抑制剂，可以抑制VEGIDR3之间的相互作用。DcR3为一种分泌性蛋白，也是TNF受体超家族中的一员，在多种恶性肿瘤中高度表达，DcR3可以使三种TNF超家族成员的分别是 FasL，LIGHT、VEGI失活［12］。Migone［3］等将仅含有胞外功能域的可溶性DR3和DcR3以2:1加入到培养基中，结果观察到DR3不能与表达VEGI的细胞表面结合。同时，在DR3转染细胞中，VEGI可以显著地激活NF-κB信号通路，而过量的DcR3却可以完全抑制这一功能。DcR3不仅仅是DR3的受体，使DR3的配体失活。它也可能是含有多种功能的细胞因子，在细胞凋亡、免疫抑制、血管生成、肿瘤进展中发挥调节作用。

VEGI基因主要在血管内皮细胞中检测到，而VEGI蛋白则表达于很多人体正常组织中，如胎盘、肾脏、肺脏、脾脏、骨骼肌、前列腺、胰腺、小肠、大肠等［2，6］。VEGI-251和VEGI-174在人体器官和组织中的分布不同［7］。Chew等［7］通过免疫蛋白印迹的方法，在胎盘、肾脏、肺脏、肝脏中检测到 VEGI-251，在肝脏、肾脏、骨骼肌、心脏中检测到 VEGI-174，而在前列腺、唾液腺、胎盘中 VEGI-251和VEGI-174重叠表达，在胎儿肾脏和肺脏中VEGI-251呈高表达，在心脏、骨骼肌、胎盘、肾上腺和肝脏中VEGI-174呈高表达。VEGI 192在体内呈低表达状态。

3 VEGI基因表达的调控

此前已有报道，TNF-α和IL-1能上调VEGI的表达，而 IF-γ 能下调 VEGI的表达［3，7，13，14］。Deng等［15］通过实验证明，在卵巢癌中 VEGF(vascular endothelial cell growth factor)和MCP-1(monocyte chemotactic protein-1)能明显下调血管内皮细胞中VEGI的表达，并随着卵巢癌的进展，VEGI表达呈下降趋势。在另一项研究中，Jang等［16］证明HD11鸡巨噬细胞中的c．MIF(chicken macrophages migration inhibitory fator)能够增加VEGI的表达。Zhou等［17］通过实验，说明在前列腺癌中，AMPK(5'adenosine monophosphate activated protein kinase)上调VEGI表达，并能够抑制肿瘤的生长。亦有Lambert等［18］证明在骨关节炎患者中，VEGI的表达受到IL-1β和硫酸软骨素的调控。Xiao等［19］在研究鼠VEGI基因启动子的实验中发现，NF-κB的两种亚型p50、p65与VEGI基因启动子相互作用，p65过表达能够上调VEGI基因，反之，p50则抑制其表达。在研究VEGI基因启动子上NF-κB结合位点的研究中，发现NF-κB结合位点是否正确，对VEGI基因的表达至关重要。Endo等［20］发现，细菌脂多糖激活的NF-κB信号通路也有参与VEGI的基因表达。这些实验研究的发现说明了，VEGI蛋白的功能是严格受到基因水平调控的。

4 VEGI在肿瘤中的功能及相关机制

4．1 抑制新生血管生成

血管生成无论是在生理或是病理情况下，都是一个非常重要的生物过程。在肿瘤生长或转移过程中，血管生成都起到决定性的作用，如果没有足够数量的血管来供应充足的氧气和营养物质，肿瘤长到一定的直径就会停滞生长。新生血管的形成包括几个连续性步骤:内皮细胞的增殖、迁移，内皮细胞围成管状结构，胞外基质的重组，血管侵入周围组织。并且血管形成的过程严格受到促血管生长因子和血管抑制因子的平衡调节［21］。当前已有很多关于血管内皮生成抑制剂以肿瘤血管作为抗癌治疗的靶点的报道，证实这些抑制剂可以在不影响正常血管功能的前提下，抑制原发性和转移性肿瘤的生长［22］。

Wu等［23］对在鸡尿绒毛膜模型中，分别使用rhVEGI-192、rhRGD-VEGI-192对鸡尿绒毛膜进行处理后，分析发现两者均能抑制新生血管的形成，分别使血管密度降低 39．39%，73．69%。Conway 等［24］将表达VEGI的质粒转染至人血管内皮细胞株中，发现基质胶中内皮细胞形成微管的能力下降。VEGI对血管内皮细胞生长的抑制作用是通过以下几点实现的:1、阻止G0/G1期的细胞进入细胞周期，阻止细胞从静止期进入分化期;2、通过与TNF受体超家族中的两种受体相互作用，即前文中提到的DR3和DcR3。DR3胞浆中有一个死亡结构域，能够诱导具有表达DR3活性的细胞株凋亡，如人类脐静脉内皮细胞。相反，很多研究均表明DcR3在恶性肿瘤，如食管癌、胃癌、胶质瘤、肺癌、大肠癌、直肠癌中呈高表达状态［19，25-28］。DcR3阻断人脐静脉内皮细胞自分泌性VEGI的抑制血管生成活性，从而增强了血管生成。同时，抗VEGI和抗DcR3抗体都能促进细胞的增殖和迁移，两种抗体的促血管生成作用机制相似，均由DR3诱导实现。VEGI诱导高度活跃的增殖细胞凋亡，是通过激活应激蛋白酶，SAPK(stress-activated protein kinase)/JNK(c-Jun N-terminal protein kinase)和P38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)以及细胞凋亡酶(主要为凋亡酶-3，caspase-3)完成的。

4．2 抑制血管内皮祖细胞(endothedial progenitor cell EPC)分化

Tian等［29］证实VEGI对原始内皮细胞的分化具有抑制作用。用rh VEGI-192治疗鼠骨髓来源的Scal+单核细胞的EPC，与对照组相比，实验组中内皮细胞标志物的表达受到明显抑制，但血管干细胞标志物的表达未见改变。同时，实验组EPCs的粘附、迁移、形成类毛细血管样结构的能力都呈下降趋势。除此之外，VEGI也能诱导分化EPCs的凋亡。VEGI可能通过抑制EPC的分化，实现对出生后血管生成的调控。VEGI通过自分泌的形式诱导血管内皮细胞凋亡［2，7，30］。

4．3 抑制肿瘤的生长

VEGI的mRNA可以在很多正常组织、肿瘤组织或肿瘤细胞株中检测到，这点正好说明了VEGI蛋白无论在生理或病理状态下都充当着调控新生血管的重要角色。在细胞和动物模型中均发现VEGI的过量表达能抑制肿瘤新生血管形成和肿瘤本身的生长［30］。Zhai等［2］通过对含有胞外结构域的重组VEGI的研究发现，VEGI在体外不仅能抑制类毛细血管样结构的生长，也能显著抑制乳腺癌和大肠癌远处转移瘤的生长。其中，VEGI-251过表达会诱导血管内皮细胞凋亡和抑制转移癌的生长，同时降低相关微血管的密度。肿瘤细胞分泌的全长VEGI-174对转移癌的生长几乎没有抑制作用，只含有特定胞外结构域的重组VEGI-174在体外实验中被证实能够抑制内皮细胞的生长。肿瘤患者使用重组人VEGI-192治疗一周后血管内皮细胞密度下降了88%，连续使用三周后密度下降程度更大，但血管平滑肌细胞的密度却保持相对稳定［8］。另外亦有研究表明VEGI蛋白的抗肿瘤作用，并非直接作用于肿瘤细胞，而是通过干扰肿瘤间质血管的生长实现的［19，31］。同时，有研究表明 VEGI对膀胱肿瘤细胞及前列腺肿瘤细胞的迁移和粘附有抑制作用［32-33］。Parr等［34］发现，乳腺癌患者中 VEGI高表达者相较低表达者，局部复发率更低，生存时间更长，预后更好。亦有Zhang等［35］发现，在肾癌转移瘤模型中，VEGI能抑制肿瘤生长，对肾癌细胞的迁移和粘附有抑制作用，且肾癌组织中VEGI的表达量比正常肾脏组织要少。

5 VEGI在恶性肿瘤放射治疗中的展望

放疗作为恶性肿瘤最常见的治疗手段之一，临床上约一半以上的肿瘤患者在治疗过程中接受过放疗。放疗的基本原理是放射线直接损伤细胞DNA(直接效应)或放射线作用到物质后产生的自由基损伤细胞的DNA(间接效应)，达到杀死细胞的目的，但特异性差，尽管近来精确放疗技术得到了很大的进步，但放疗的治疗效果仍不胜满意。这可能与肿瘤细胞自身乏氧状态和对应射线敏感性差有关。

在有氧条件下，细胞对射线的敏感度是乏氧状态下的3倍。在1950s，放射学家们首度证实氧供和肿瘤生长密切相关，肿瘤组织中乏氧细胞的存在是产生放疗抵抗性的原因。由于促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡，使内皮细胞大量增殖，过量的内皮细胞和异常的周围细胞形成迂曲扩张的囊状肿瘤血管。我们都知道，氧气是一种强效的射线增敏剂。传统观点认为，联合使用放疗和抗血管生成药物会减少肿瘤血管的数目，降低肿瘤组织血流灌注，从而降低肿瘤血管内的血氧浓度，降低PO2和PH，反而减低了肿瘤的射线敏感性，不宜联合使用。但是，Jain［36-37］提出“肿瘤血管正常化的概念”，抗血管生成药物可以重新组织紊乱的肿瘤血管系统，将其重塑至接近正常，这种肿瘤血管的正常化，使得肿瘤血管系统功能暂时改善，组织间液压力降低，氧合作用增强，显著提高放疗的抗肿瘤效果。这为抗血管生成药物与放疗联合应用找到了最有力的理论依据。

Teicher等［38］最先发现，抑制血管的生成可以增强放疗的治疗效果。近年来不断有研究提示抗血管生成药物联合放疗能提高肿瘤治疗效果，临床前研究和临床研究均发现联合使用抗血管生成药物能在治疗早期改善肿瘤乏氧状况，确实对肿瘤放疗有增敏效应，能抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积。

VEGI作为一种新型的抗血管生成药物，能强力地抑制新生血管生成，显著抑制肿瘤生长，并且对肝肾几乎无毒性［8］。VEGI目前处于临床前研究阶段，尚未投入临床使用。如前所述，rhVEGI-192对血管生成的抑制作用是抗血管生成药物endostatin的20倍。已有研究发现，endostatin能够使肿瘤血管正常化［39］，VEGI能否也有使肿瘤血管正常化的现象，更大程度地改善肿瘤乏氧状态，修剪未成熟血管，增强放疗效果;VEGI最佳给药剂量的确定以及血管正常化窗口期在用药后多久出现，如何与放疗最佳联合应用等，都迫切需要我们深一步的研究。

［1］ Baud V，Karin M．Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives［J］．Trends Cell Biol，2001，11(9):372-377．

［2］ Zhai Y，Ni J，Jiang GW et al．VEGI，a novel cytokine of the tumor necrosis factor family，is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo［J］．FASEB J，1999，13(1):181-189．

［3］ Migone TS，Zhang J，Luo X，et al．TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TD6/DcR3 and functions as a T cell costimulator［J］．Immunity，2002，16(3):479-492．

［4］ Yu J，Tian S，Metheny-Barlow L，et al．Modulation of endothelial cell growth arrest and apoptosis by vascular endothelial growth inhibitor［J］．Circ Res，2001，89(12):1161-1167．

［5］ Tan KB，Harrop J，Reddy M，et al．Characterization of a novel TNF-like ligand and recently described TNF ligand and TNF receptor superfamily genes and their constitutive and inducible expression in hematopoietic and non-hematopoietic cells［J］．Gene，1997，204(1-2):35-46．

［6］ Bodmer JL，Schneider P，Tschopp J．The molecular architecture of the TNF superfamily［J］．Trends Biochem Sci，2002，27(1):19-26．

［7］ Chew LJ，Pan H，Yu J，et al．A novel secreted splice variant of vascular endothelial cell growth inhibitor［J］．FASEB J，2002，16(7):742-744．

［8］ Hou W，Medynski D，Wu S，et al．VEGI-192，a new isform of TNFSF15，specifically eliminates tumor vascular endothelial cells and suppresses tumor growth［J］．Clin Cancer Res，2005，11(15):5596-5602．

［9］ Jin T，Guo F，Kim S，et al，X-ray crystal structure of TNF ligand family member TL1A at 2．1 A［J］．Biochem Biopys Res Commun，2007，364(1):1-6．

［10］ Zhan C，Yan Q，Patskovsky Y，et al．Biochemical and structural characterization of the human TL1A ectodomain［J］．Biochemistry．2009;48(32):7636-7645．

［11］ Sethi G，Sung B，Aggarwal BB．Therapeutic potential of VEGI/TL1A in autoimmunity and cancer［J］．Adv Exp Med Bio，2009，647:207-215．

［12］ Ge Z，Sanders AJ，Ye L，et al．Aberrant expression and function of death receptor-3 and death decoy receptor-3 in human cancer［J］．Exp Ther Med．2011，2(2):167-172．

［13］ Kang YJ，Kim WJ，Bae HU，et al．Involvement of TL1A and DR3 in induction of pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase-9 in atherogenesis［J］．Cytokine，2005，29(5):229-235．

［14］ Lu Y，Gu X，Yao Z，et al．Interferon-γproduced by tumor-infiltrating NK cells and CD4+T cells downregulates TNF15 expression in vascular endothelial cells．Angogenesis;2013 Oct 20．［Epub ahead of print］．

［15］ Deng W，Gu X，Lu Y，et al，Down-modulation of TNFSF15 in ovarian cancer by VEGF and MCP-1 is a pre-requisite for tumor neovascularizaition［J］．Angiogenesis，2012，15(1):71-85．

［16］ Jang SI，Lillehoj HS，Lee SH，et al．Distinct immunoregulatory properties of macrophage migration inhibitory factors encoded by Eimeria parasites and their chicken host［J］．Vaccine，2011，29(48):8998-9004．

［17］ Zhou J，Yang Z，Tsuji T，et al．LITAF and TNFSF15，two downstream targets of AMPK，exert inhibitory effects on tumor growth［J］．Oncogene，2011，30(16):1892-1900．

［18］ Lambert C，Mathy-Hartert M，Dubuc JE，et al，Characterization of synovial angiogenesis in osteoarthritis patients and its modulation by chodroitin sulfate［J］．Arthritis Res Ther，2012，14(2);R58．

［19］ Xiao Q，Hsu CY，Chen H，et al，Characterization of cis-regulatory elements of the vascular endothelial growth inhibitor gene promoter［J］．Biochem J，2005，388(pt3):913-920．

［20］ Endo K，Kinouchi Y，Kakuta Y，et al．Involvement of NF-kappaB pathway in TL1A gene expression induced by lipopolysaccaride［J］．Cytokine，2010，49(2):215-220．

［21］ Carmeliet P．Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis［J］．Nat Med，2000，6(4):389-395．

［22］ Cai J，Wei R，Cheng J．Preparation and characterization of a novel chimeric protein VEFI-CTT in Escherichia coli［J］．J Biomed Biotechnol，2008，2008:ID564969，9pages．

［23］ Wu JH，Jiang Y，Yang W，et al．Dual function of RGD-modified VEGI-192 for breast cancer treatment［J］．Bioconjugate Chem，2012，23:796-804．

［24］Conway KP，Prince P，Harding K G，et al．The role of vascular endothelial growth inhibitor in wounding healing［J］．Int Wound J，2007，4(1);55-64．

［25］ Jin T，Kim S，Guo F，et al．Purification and crystallization of recombinant human TNF-like ligand TL1A．［J］Cytokine，2007，40(2):115-122．

［26］ Bamias G，Mishina M，Nyce M，et al．Role of TL1A and its receptor DR3 in two models of chronic murine ileitis［J］．Proc Natl Acad Sci USA．2006，103(22):8441-8446．

［27］ Cassatella MA，Pereira-da-Silva G，Tinazzi I，et al．Soluble TNF-like cytokine(TL1A)production by immune complexes stimulated monocytes in rheumatoid arthritis［J］．J Immunol，2007，178(11):7325-7333．

［28］ Prehn JL，Thomas LS，Landers CJ，et al．The T cell costimulitor TL1A is induced by FcgammaR signaling in human monocytes and dendritic cells［J］．J Immunol，2007，178(7):4033-4088．

［29］Tian F，Liang PH，Li LY，et al．Inhibition of endothelial progenitor cell differentiation by VEGI［J］．Blood，2009，113(21):5352-5360．

［30］ Yue TL，Ni J，Romatnic AM，et al．TL1，a novel tumor necrosis factor-like cytokine，induces apoptosis in endothelial cells．Involvement of activation of stress protein kinases(stress-activated protein kinase and p38 mitogen-activated protein kinase)and capase-3-like protease［J］．J Biol Chem，1999，274(3):1479-1486．

［31］ Yang CR，Hsieh SL，Teng CM，et al．Soluble decoy receptors 3 in-duces angiogenesis by neutralization of TL1A，a cytokine belonging to tumor necrosis factor superfamily and exhibiting angiostatic action［J］．Cancer Res，2004，64(3):1122-1129．

［32］ Zhang N，Sander AJ，Ye L，et al．Expression of vascular endothelial growth inhibitor(VEGI)in human urothelial cancer of the bladder and its effects on the adhesion and migration of bladder cancer cells in vitro［J］．Anticancer Res．2010;30:87-95．

［33］ Zhang N，Sander AJ，Ye L，et al．Vascular endothelial growth inhibitor，expression in human prostate cancer tissue and the impact on adhension and migration of prostate cancer cells in vitro［J］．Int J Oncol．2009;35;1473-1480．

［34］ Parr C，Gan CH，Watkins G，et al．Reduced vascular endothelial growth inhibitor(VEGI)expression is associated with poor prognosis in breast cancer patients［J］．Angiogenesis．2006;9:73-81．

［35］ Zhang N，Wu P，Shayiremu D，et al．Suppression of renal cell carcinoma growth in vivo by forced expression of vascular endothelial growth inhibitor［J］．Int J Oncol，2013，42(5):1664-73．

［36］ Dicker，et al．Phase I trial results of recombinant human angiostatin protein(rhA)and external beam radiation therapy(EBRT)．In:38th Annnual meeting of the American Association of Clinical Oncology．Alexandria，VA:ASCO publications，2002．

［37］ Jain RK．Normalizating tumor microenvironment to treat cancer:bench to beside to biomarkers［J］．J Clin Oncol，2013，31(17):2205-2218．

［38］ Teicher BA，Holden SA，Ara G，et al．Influence of all anti-angiogenic treatment on 9L gliosarcoma，oxygenation and response to cytotoxic therapy［J］．Int J Cancer，1995，61(5):732．

［39］彭 芳，王 谨，邹 毅，等．重组内皮抑素对肿瘤血管结构和乏氧改善作用的实验观察［J］．中华放射肿瘤学杂志，2011，1(20):69-72．