胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

陈 江 牟为民 邵晓东 王 迪 许文达 郭晓钟

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

陈 江1牟为民2邵晓东1王 迪1许文达1郭晓钟1

目的观察人胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell袁DC)体外激发抗—特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力遥方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC遥使用电穿孔法将M iaPaCa-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1 mRNA转染DC袁以未负载抗—的DC为对照遥采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达遥四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化曰混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力曰ELISA法检测各组DC体外激发抗—特异性CTL细胞因子释放量遥结果M iaPaCa-2总RNA与MUC1mRNA分别转染后48 h DC中目标抗—的相对表达量分别为37.24依3.17和34.53依2.02袁两者比较无显著差异(P>0.05)遥电转染后96 h MiaPaCa-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%袁低于MUC1mRNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P<0.05)遥转染M iaPaCa-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432依611.25袁显著高于MUC1单独转染组3 664依305.17(P<0.05)曰且转染M iaPaCa-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平亦显著高于MUC1mRNA单独转染组(P<0.05)遥结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗—负载DC有更强的体外抗—特异性CTL激发能力。

树突细胞曰RNA转染曰胰腺肿瘤曰细胞毒性T淋巴细胞

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤袁多数病例在发现时已属晚期袁手术治疗及放、化疗作用有限袁患者预后极差袁临床迫切需要探索新的有效治疗手段[1-2]遥近年来新兴的肿瘤生物免疫治疗技术对多种类型肿瘤均有显著的治疗作用[3-5]袁树突状细胞(Dendritic cell,DC)是体内功能最为强大的抗—递呈细胞(antigen presenting cell,APS)袁能够刺激并致敏栽淋巴细胞袁产生细胞毒性栽淋巴细胞(cytotoxic T lynphocytes,CTLs)袁启动机体免疫应答遥以DC为基础构建的肿瘤疫苗技术作为肿瘤生物治疗的核心策略袁为胰腺癌的临床治疗开辟了新的思路遥本研究将人胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA电转染DCs袁观察其在体外诱导并激发抗—特异性CTL的能力袁为今后胰腺癌肿瘤细胞全抗—DC疫苗的开发和临床应用提供基础资料。

材料与方法

一、一般材料及试剂

筛选2012年6月至2014年3月期间沈阳军区总医院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者袁男性4例袁女性2例袁年龄35~65岁袁平均年龄50岁遥全部患者均经组织病理学检查(剖腹探查活检4例袁细针穿刺活检2例)证实为胰腺癌遥入选前未经放、化疗及免疫治疗遥所有患者均签署知情同意书袁并经本院伦理委员会批准。

人胰腺癌细胞株M iaPaCa-2(沈阳军区总医院消化科实验室)曰RPM I1640、小牛血清(Hyclone公司袁美国)袁rhGM-CSF、rhIL4、TNF琢(PeproTec公司袁美国)袁鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86单抗(Santa-Cruz公司袁美国)袁TRIzol、MTT、DM—SO、Ficoll淋巴细胞分离液(Sigma公司袁美国)袁3H标记甲基胸腺嘧啶(中科院—子能所)袁IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌细胞因子检测试剂盒(BD公司袁美国)袁Sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司袁德国)曰荧光实时定量PCR仪(GE公司袁澳大利亚)。

二、DC的分离、培养和鉴定

参照文献[6]方法袁通过Ficoll密度梯度离心法袁分离来自胰腺癌患者100m L外周血中的PBMCs袁贴壁1h后袁取出未贴壁的细胞另作培养备用遥贴壁细胞继续培养20 h后更换新鲜培养液袁加入rhGMCSF(800 IU/mL)和rhIL-4(500 IU/m L)遥37益袁5% CO2袁培养5 d后加入TNF-琢(10 ng/m L)袁培养至7 d袁收集成熟DCs遥使用倒置显微镜和电镜连续观察体外培养5~10 d DCs形态学变化遥用流式细胞仪分析DCs的特征性标志CD40、DC特征性成熟标志CD83、共刺激分子CD86以及MHC类分子HLA-DR等的表达水平。

三、M iaPaCa-2细胞总RNA提取和鉴定

收获胰腺癌M iaPaCa-2细胞袁加入Trizol试剂1m L充分裂解袁5 m in后加入氯仿200L袁4益12 000 r/m in离心15m in袁加入异丙醇500L袁室温放置20m in袁4益12000 r/m in离心15m in袁弃上清袁加入75%乙醇1 m L漩涡器震荡混均袁4益12 000 r/ m in离心15min遥弃上清袁超净台晾干后溶于25L DEPC水遥分光光度计测定A260/A280值袁计算RNA纯度和含量袁1%变性凝胶电泳测RNA完整性后-80益保存。

四、体外扩增MUC1mRNA及DCs的转染

采用Primer prem ier 5.0软件设计MUC1及次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase,HPRT)引物袁并经GenBank验证遥以HPRT基因作为校正目标基因表达的看家基因遥MUC1引物上游院5忆-TGA GTG ATG TGC-3忆、下游院5忆-CTG CCCGTAGTTCTT TCG-3忆曰扩增产物大小158 bp遥HPRT引物上游院5忆-GGT TCT CGG GGC ACC TCT-3忆、下游院5忆-TCG GCT TGA AAT GACCTA ATG-3忆袁扩增产物大小221 bp遥按Sen—siscriptRTKit说明袁将步骤三获得的M iaPaCa-2细胞总RNA经逆转录、扩增得到MUC1 cDNA袁而后以1g样本为模板袁按照T7mMessagemMachine试剂盒说明于37益2~4 h体外转录、扩增为MUC1mRNA袁计算RNA纯度、含量并测完整性后保存。

[7]的方法院取200L培养5 d的未成熟DCs细胞悬液加入2mm的电极杯袁分别加入20gM iaPaCa-2总RNA和MUC1mRNA遥调整电压300 V袁间隔125 ms袁4个脉冲袁持续250ms进行电转染遥电穿孔后立刻置入4益冰箱静置10m in袁移入加有完全培养基的12孔培养板中袁37益、5%CO2培养0~96 h遥同时袁以未转染RNA的mock-DC作为对照组。

五、RNA转染后DC中MUC1表达检测

收集1伊106个不同转染组DCs袁用TRIzol法提取总RNA袁按照QuantiTect SYBRGreen PCR试剂盒说明袁行实时定量PCR反应院95益起始变性15 m in袁94益变性20 s袁60益退火20 s袁72益延伸20 s袁共40个循环袁最后68益60 s中止反应曰根据参考文献[8]的方法袁用双标准曲线法[(待测样品目的基因浓度/待测样品看家基因浓度)/(对照组目的基因浓度/对照组看家基因浓度)]袁对两组DC内的MUC1基因进行相对定量测定袁每个样品重复2次袁取均值遥同时袁使用MTT法检测DC存活率变化。

六、不同RNA转染组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖实验

分别收集不同转染组DCs袁调节细胞浓度为1伊105/mL作为刺激细胞袁分选并调节患者自体PBMCs中的悬浮T淋巴细胞袁浓度为1伊106/mL作为反应细胞袁按照刺激与效应细胞l:10袁l:20袁l:40和l:80比例加入到96孔板中袁终体积200L袁在37益袁5%CO2培养5 d袁收获细胞前18 h加入3HTdR袁每孔1Ci遥以RPM I-1640培养基替代效应细胞的4个孔做为对照组袁使用液闪烁仪检测每分钟脉冲数(CPM)。

七、不同RNA转染组DC体外激发抗—特异性CTL释放细胞因子

以不同转染组DCs为刺激细胞袁以患者自体T淋巴细胞为效应细胞袁刺激与效应细胞按l:10比例混合反应14 d后袁应用ELISA法袁按试剂盒操作说明书检测细胞培养上清中IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌水平遥细胞培养上清用试剂盒中样本稀释液稀释50倍后检测遥每样本设2个复孔袁取平均值。

八、统计学处理

使用SPSS 13.0软件进行统计分析袁计数资料以%表示袁采用字2检验曰计量资料以x依s表示袁采用student-t检验袁P约0.05时判定具有统计学意义。

结果

一、DC的分离、培养和鉴定

DC经体外分离、培养袁数量可达初始数量的10~15倍遥镜下可见胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起袁部分突起末端呈球状膨大(见图1)遥同时可见转染目标RNA后成熟DC表面标志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的表达均显著升高袁见表1。

图1 体外培养的胰腺癌患者外周血DC细胞形态学表现(A院培养第5天光镜伊200曰B院培养第7天成熟DC光镜伊400)

表1 流式细胞学检测未成熟和成熟DC表型特征(n=6)

二、RNA转染组DC内MUC1抗—的表达

实时定量PCR结果显示袁分别来自6名患者的DCs经RNA电转染48 h袁M iaPaCa-2总RNA转染组DCs、体外扩增MUC1mRNA转染组DCs及mock DCs在RNA水平均可检测到MUC1的阳性表达遥其中袁M iaPaCa-2总RNA转染组DCs内MUC1相对表达量(37.24依3.17)与体外扩增MUC1mRNA转染组DCs内目标抗—相对表达量(34.53依2.02)比较袁无明显差异(P>0.05)曰但mock DCs内MUC1mRNA的相对表达量仅为4.19依0.52袁远低于各RNA转染组(P<0.05)袁见图2。

图2 电转染48h后MUC1抗—在不同RNA转染组DCs及mock DCs内的相对表达情况(n=6)

三、RNA转染组DCs细胞存活率变化情况

MUC1单抗—mRNA转染后0~96 h袁DCs存活率变化较小袁稳定在80%左右袁而M iaPaCa-2细胞总RNA转染后DCs存活率呈现时间依赖性降低袁96 h时DC存活率低至60.81%(P<0.05)袁见图3。

图3 RNA电转染不同时间点DCs细胞存活率变化情况转染后96 h袁M iaPaCa-2总RNA转染组DCs细胞存活率显著低于MUC1mRNA转染组DCs(*P<0.05)

四、不同RNA转染组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖实验

以M iaPaCa-2总RNA转染组DCs、体外扩增MUC1mRNA转染组DCs及mock DCs作为刺激细胞袁各组细胞与自体T淋巴细胞混合培养袁结果显示在DC:T=1:10时袁DC-M iaPaCa-2 totalRNA组DCs刺激自体T细胞增殖指数为8 432依611.25袁显著高于DC-MUC1组3 664依305.17(P< 0.05)及Mock DC组257依32.16(P<0.05)曰且在DC:T=1:20时袁DC-M iaPaCa-2 total RNA组DCs刺激自体T细胞增殖指数为6152依153.03袁亦显著高于DC-MUC1组2 376依130.01(P<0.05)及M ock DC组108依17.18(P<0.05)曰而当DC:T=1: 40及1:80时袁DC-M iaPaCa-2 total RNA转染组与DC-MUC1组刺激自体T细胞的增殖指数无显著差异(P跃0.05)(图4)。

图4 不同RNA转染组DC刺激自体T细胞增殖实验

五、不同RNA转染组DC体外激发抗—特异性CTL释放细胞因子

M iaPaCa-2总RNA转染组DCs、体外扩增MUC1mRNA转染组DCs及mock DCs均具有刺激抗—特异性CTL分泌Th1型细胞因子的能力袁但Mock DCs对CTLs的刺激作用较弱袁几可忽略不计遥ELISA法检测示袁在DC:T=1:10时袁M iaPaCa-2总RNA转染组DCs能激活自体特异性T细胞袁其诱导特异性CTL分泌的IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平袁显著高于MUC1mRNA转染的DCs组(P<0.05)(图5)。

图5 不同RNA转染组DC刺激特异性CTLs分泌细胞因子情况

讨论

免疫逃避是胰腺癌患者的常见事件袁而提高机体抗肿瘤免疫反应可能是临床治疗胰腺癌的有力手段遥DC在免疫反应进程中可捕获、处理、提呈肿瘤细胞抗—袁引起初级和次级免疫反应等特殊功能[9]遥使用不同的方法使之负载肿瘤抗—袁制备DC肿瘤疫苗诱导机体产生抗—特异性抗肿瘤免疫应答已成为近年来肿瘤免疫治疗的研究热点之一遥DC肿瘤疫苗的实质是以特异性T细胞为基础的细胞免疫袁有关胰腺癌DC疫苗构建的一个关键问题在于选择合适的肿瘤抗—遥胰腺癌缺乏特异性肿瘤抗—、异质性大、免疫—性差袁使用单肿瘤抗—负载DC构建胰腺癌肿瘤疫苗时袁其诱导的免疫反应通常较弱曰而使用肿瘤全抗—负载DC构建胰腺癌疫苗则可激活针对不同肿瘤特异性抗—的多克隆细胞袁减少肿瘤细胞克隆变异引起的抗—缺失袁从而可以减少免疫逃逸的发生率袁理论上是一种较具优势的DC肿瘤疫苗的构建方法[10]。

MUC1是高糖基化玉型糖蛋白的一种袁其蛋白分子较易被免疫细胞所呈递和识别[11]遥同时袁MUC1的表达具有高度的肿瘤特异性袁在胰腺癌细胞中的阳性表达率可达90%以上袁因此被认为是胰腺癌免疫治疗的一个重要靶点[12]遥本研究引入MUC1作为研究对象的目的在于院MUC1基因稳定内嵌在胰腺癌肿瘤细胞全抗—标志物袁检测胰腺癌全肿瘤抗—负载后其在DC中的相对表达数量及效率袁即可间接判定肿瘤全抗—负载的多少与效率[13]。

RNA电转染法具有操作简单、安全、不受MHC遗传背景影响等优点[14]遥我们的研究发现袁利用RNA电转染技术袁胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA可成功负载DC袁且转染过程中未出现抗—不良交互反应遥MUC1标志物抗—在转染M iaPaCa-2总RNA组和MUC1mRNA组DCs中均有阳性表达袁且此两RNA转染组DCs内MUC1的相对表达水平无显著差别遥这一现象说明袁与经过体外转录、扩增的单肿瘤抗—RNA转染相比较袁胰腺癌细胞总RNA转染在抗—负载能力及效率方面袁并不落下风遥MUC1单抗—RNA转染0~96 h袁DC存活率稳定在80%左右袁而胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA转染DC后袁细胞存活率在不同的时间点明显降低遥此现象可能与DC转染的RNA剂量过多引起的毒性增加有关。

本实验研究中袁我们将M iaPaCa-2细胞总RNA转染组及MUC1mRNA单独转染组DCs与自体T细胞混合培养袁结果显示在不同效靶比情况下袁不同RNA转染组DCs均能刺激自体T细胞增殖曰但M iaPaCa-2总RNA转染组DC对自体T细胞的增殖刺激能力显著高于MUC1mRNA单独转染组DC袁提示随着负载抗—表位的增加袁DC刺激自体T细胞增殖的能力亦可显著增强遥DC肿瘤疫苗的最终目的在于其诱导体内CTL反应袁进而对肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应遥随着T细胞的增殖和特异性CTL的扩增袁活化的CTL可分泌大量Th1型的细胞因子如IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌等袁故而DC对体外CTL的刺激活化能力可间接使用IFN-酌等细胞因子的释放量表示[15]遥本研究发现袁M iaPaCa-2细胞总RNA转染组及MUC1 mRNA单独转染组DCs均具有体外激发CTL的能力袁但M iaPaCa-2总RNA转染可使DCs表现出较单抗负载时更强的CTL激发效应遥此发现与Van Tendeloo等的研究结果[16]类似遥提示DC体外激发特异性CTL的能力可能与其所负载抗—表位的数目有关袁而与转染RNA的剂量无关遥即随着DC负载的抗—表位数量的增加袁其体外活化、激发抗—特异性CTL的能力亦会显著增强。

综上所述袁本研究结果表明转染了人胰腺癌M iaPaCa-2细胞总RNA的DCs可在体外显著促进抗—特异性CTL的增殖和活化袁此结果为胰腺癌肿瘤细胞全抗—DC疫苗的开发和临床应用提供了部分理论和实验基础。

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The induction of specific cytotoxic T lymphocytes by the dendritic cells transfected with total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cells in vitro

CHENJiang1,MUWei-min2,SHAO Xiao-dong1,WANGDi1, XUWen-da1,GUOXiao-zhong1.1)
DepartmentofGastroenterology,Shenyang General Hospital ofPeople忆s Liberation Army,Shenyang,110840,China;2)Departmentof Gastroenterology,No.222 HospitalofPeople忆s Liberation Army,Jilin,132011,China.Corresponding author:GUO Xiao-Zhong,E-mail:Guoxi—aozhong1962@aliyun.com

Objective To investigate the ability of induction of specific cytotoxic T lymphocytes(CTL) stimulated by dendritic cells(DC)transfectedw ith total RNA of human pancreatic cancerM iaPaCa-2 cell lines.M ethod DCswere isolated and cultured from peripheral bloodmononuclearcells(PBMCs).Total RNA derived from MiaPaCa-2 cell lines and MUC1mRNA were transfected into DCs by electroporation respec—tively.The expression of MUC1 in DCswas detected by quantitative real-time PCR.The survival rate of transfected DCswere determined by MTT method.The lymphocyte proliferation ability was evaluated by m ixed cell culturemethod.The cytokinesreleasing of antigen-specific CTLsweremeasured by ELISA assay. Results A fter totalRNA ofMiaPaCa-2 cell linesand MUC1 mRNA transfection for 48h,the expression of MUC1 were 37.24依3.17 and 34.53依2.02(P>0.05).After MUC1mRNA was individually transfected,the survival rate of DCsw as stabilized around 80%,and the survival rate of DCswas 60.81%96 hoursafter the totalRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfection(P<0.05).Theautologous T cell proliferation index of the to—talRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfectionwas 8,432依611.25 in DC group,whichwassignificantly higherthan the single MUC1 transfection group(3,664依305.17)(P<0.05).The levelsof IL-2,IL-10,Granzyme B,IFN-酌secretedby MUC1 and the total RNA ofM iaPaCa-2 cell line transfected DC-specific CTL were significantly higher than MUC1m RNA alone transfection group(P<0.05).Conclusion DCs transfectedw ith the total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cell lineshave a stronger ability to stimulate specific CTL in vitro than the single antigen loaded DCs.

Dendriticcells;RNA transfection;Pancreatic cancer;Cytotoxic T lymphocytes

院2014-06-12)

(本文编辑院郭文)

DOI院10.3969/j.issn.1672-2159.2014.05.008

院1 110016沈阳军区总医院消化科曰2 132011解放军222医院消化科

院郭晓钟袁E-mail:Guoxiaozhong1962@163.com

院国家自然科学基金资助项目(81071982)