基层医院呼吸道合胞病毒检测方法的筛选

许 琴 林素香 郑水华

珠海第二人民医院检验科，广东珠海 519000

呼吸道合胞病毒是婴幼儿呼吸道严重感染的最重要的病毒病原之一，流行面广、发病率高[1-2]。目前尚无特异预防措施，RSV感染及其预后是严重的公共健康问题。基层医院迫切需要一种快速、可靠、易推广的RSV早期诊断方法。本研究选择50例PCR-荧光探针和临床确诊的RSV感染患儿鼻咽分泌物，分别用双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光法(DFA)、免疫层析金标法（ICA）、桥联酶标法(APAAP)检测呼吸道RSV抗原，为基层医院筛选快速、准确、方便的检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年3-4月珠海第二人民医院住院患儿50例 （男28、女 22 例）,年龄（0～12 岁），经 PCR-荧光探针和临床确诊的RSV感染患儿的鼻咽分泌物。

1.2 试剂与仪器

D3UltraTMDFA试剂盒(Quidel)、双抗体ELISA试剂盒（北京科斯塔）、单克隆抗体桥联酶标诊断试剂盒（上海瑞齐）、RSV金标免疫法（深圳赛尔）、荧光显微镜（Olympus）。

1.3 方法

1.3.1 DFA法检测RSV病毒抗原 患儿鼻咽分泌物1 mL，加PBS，吸管吹打，2000rpm离心弃上清、吸取细胞悬液25 μL，点于带孔玻片丙酮固定。滴加荧光标记的抗体37℃30 min，洗片后封片，荧光显微镜观察。

1.3.2 金标法ICA法 向反应板标本孔滴加标本,15 min后观察反应板孔中C端和T端有无红色圆斑。

1.3.3 双抗体夹心ELISA法 取试剂盒包被板每孔滴加稀释液和标本,阴阳对照孔分别加入阴、阳对照液，置37℃40min，洗涤甩干加酶标记物,置37℃20 min,洗涤甩干加底物液。酶标仪450nm波长比色,空白孔调零，标本OD值与阴性对照孔OD值比值≥2.1为阳性。

1.3.4 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法 (APAAP)样本加PBS吹打离心弃上清，细胞悬液加封闭液后冲洗；加一抗后冲洗；加二抗后冲洗；加底物液5g/L甲基绿负染冲洗，普通光学镜下(10×40)镜检。

1.4 统计学处理

采用SPSS 10.0软件,对计数资料进行χ2检验,比较各方法间阳性率的差别。

2 结果

DFA法：荧光显微镜下细胞内呈现黄绿色荧光为阳性，未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被Evans蓝染成红色。放大200倍时，在视野中找到≥2个阳性细胞，判为标本阳性，50例标本中44为阳性，RSV阳性检出率为88%。ICA法：反应板孔C端和T端均出现红色圆斑为RSV阳性，反应板孔C端出现红色圆斑，T端不出现红色圆斑为RSV阴性,反应板孔C端或C端、T端均不出现红色圆斑为失效，50例标本中42为阳性，阳性率84%。双抗体夹心ELISA法：50例鼻咽分泌物阳性20例，阳性率40%。APAAP法：普通光学显微镜下，RSV感染的鼻咽分泌物纤毛柱状上皮细胞胞质和膜可特异地染成玫瑰红色，核呈淡蓝色或无色，≥3个以上典型着色细胞判为阳性，50例标本中40为阳性，阳性率80%。见表1。

表1 四种快速检测RSV阳性率(%)比较

3 讨论

呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒,这种病毒性肺炎也是婴儿猝死的病因之一[3-4]。目前临床常用检测RSV感染的方法有分离培养鉴定、间接荧光免疫法、直接荧光免疫法、桥联酶标免疫法、核酸检测、ELISA法。病毒分离培养虽是金标法，但费时、实验要求及成本高，不易获得成功，不适合临床早期诊断和应急诊断需要。核酸杂交、RT-PCR技术检测RSA感染，敏感性、特异性高，能进行微量检测及RSA分型（A、B亚型），但实验条件要求严格，成本高，难以在基层医院普及。故本研究用DFA、ICA、APAAP、双抗体夹心ELISA四种方法检测RSV抗原，以筛选快速、准确、方便的适合基层医院检测方法。

标本选自2014年3—4月确诊RSV感染小儿鼻咽分泌物。DFA、ICA、APAAP、双抗体夹心ELISA四种方法检测出的RSV阳性率依次为 88%(44/50)、82%(42/50)、80%(40/50)、40%(20/50)。经统计学处理，前3种方法,无显著差异;双抗体夹心ELISA法与前三种方法相比，RSV阳性检出率明显低于其它三种检验方法,差异有显著性。RSV成熟时,RSV病毒大部分在细胞内[5]。双抗体夹心ELISA法检测的是细胞外的病毒蛋白,当浓度低于ELISA法检测蛋白灵敏度的下限时检测不到病毒蛋白；另感染RSV后,需要一定的时间才能产生RSV-Ag,且RSV-Ag效价低也直接影响检测，因此该方法易造成阳性样本漏检。Koetz报道,ELISA检测RSV病毒其灵敏度不如免疫荧光技术，与本研究结果相符。ELISA法虽然易掌握，快速，但阳性率低，不适合临床应用。DFA法检测的是细胞内的病毒蛋白,故病毒蛋白的质量浓度相对较高,此外DFA灵敏度高，能检出病毒的最低浓度为1.0PFU，阳性检出率88%为四种方法中最高。与其它三种方法相比，直接免疫荧光法灵敏度、特异性高[6]、操作简便，更符合基层医院的快速、简单、准确的诊断要求。国外对呼吸道病毒的检测大多采用DFA检测[7]。金标ICA法阳性率为84%，与DFA法相比，两种检测方法灵敏度无统计学意义,与文献报道一致[8]。金标法操作简便快速,30min可出结果,不需要贵重仪器,故金标法可作为基层医院门诊筛查。APAAP法在普通光学显微镜下可辨认，基层APAAP可开展,但与DFA相比，操作步骤多，易出现非特异性着色，时间长（3～4 h）。

综上所述，ELISA灵敏性、操作性最差，不适合临床推广使用；APAAP法步骤多，耗时长，不宜推广；金标法灵敏度较高，可作为基层医院门诊筛查；直接免疫荧光法简单、快速、敏感度和特异性高，是基层医院RSV感染早期诊断的优选方法，适合基层医院推广应用。

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