HPLC-q/LTQ-MS法测定肉及肉制品中10 种β-受体激动剂

张 旖，赵善贞，曲 栗，曹 晨，时逸吟，伊雄海

（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

HPLC-q/LTQ-MS法测定肉及肉制品中10 种β-受体激动剂

张 旖，赵善贞*，曲 栗，曹 晨，时逸吟，伊雄海

（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

建立基质分散固相萃取-高效液相色谱-四极杆串联线性离子阱质谱法快速测定肉和肉制品中的克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、妥布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗以及苯乙醇胺A 10 种β-受体激动剂。猪肉、肠衣和午餐肉中的β-受体激动剂经乙腈提取后，采用基质分散固相萃取净化，内标法定量。方法按照多反应监测、信息相关采集、增强离子扫描，结合10 种β-受体激动剂标准的子离子谱库检索进行分析，可对试样中10 种β-受体激动剂同时进行定性、定量测定。结果表明，克仑特罗在0.05～0.5 ng/mL质量浓度范围内，其余9 种药物残留在0.5～5 ng/mL质量浓度范围内线性良好，相关系数（r2）均大于0.99。克仑特罗定量限为0.05 μg/kg，其余9 种药物定量限为0.5 μg/kg。10 种β-受体激动剂在猪肉、肠衣和午餐肉中平均回收率分别在85.6%～118.4%、85.6%～119.2%、80.4%～118.4%之间（n=6），相对标准偏差在1.47%～14.4%、2.45%～15.4%、1.04%～12.5%之间（n=6）。方法可对猪肉、肠衣、午餐肉等肉和肉制品中10 种β-受体激动剂药物的定性同时进行定量测定。

β-受体激动剂；基质分散固相萃取；高效液相色谱-四极杆-线性离子阱质谱；肉与肉制品

克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、妥布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗以及苯乙醇胺A等均属于β-受体激动剂，能与肾上腺素受体结合，临床上主要用于治疗人的哮喘、支气管痉挛等。猪食用该类物质后在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高猪肉的瘦肉率。但是人食用含有上述物质的畜产品常会引起心律失常、心慌、心悸、甲状腺机能亢进等中毒症状。除莱克多巴胺以外，欧盟、美国等一些发达国家纷纷禁止使用上述兽药，我国早在2003年已经明确将该类药物列入农业部公告第176号《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》[1]。其中苯乙醇胺A，又称克仑巴胺，是我国首先发现的一种新型“瘦肉精”，2010年12月列入农业部公告第1519号《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》[2]。

在β-受体激动剂监督检测过程中，唾液[3]、尿液[4]、血液[5]、动物组织[6]、毛发[7]等都可作为检测对象。对于β-受体激动剂类物质的检测方法主要有酶联免疫法[8]、高效液相色谱法[9]、气相色谱-质谱法[10-11]和液相色谱-质谱-质谱法[12-17]等，其中酶联免疫法和高效液相色谱法现在多用于样品中β-受体激动剂的快速筛查，液相色谱-质谱-质谱法是目前常用的确证方法。

现有上述报道中，对于β-受体激动剂的前处理多采用固相萃取柱净化，较为复杂，且尚未有采用四极杆-线性离子阱质谱仪对上述药物同时定性、定量测定的报道。高效液相色谱-四极杆-线性离子阱质谱（high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry，HPLC-q/LTQ-MS）法检测具有从多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）、信息相关采集（information dependent acquisition，IDA）、增强子离子扫描（enhanced product ion scan，EPI）、谱库检索的独有检测模式，能够实现对未知化合物同时定性定量的目的[18-20]。本方法前处理操作简便、精密度和准确度较高，分析时间短、净化效果好，可对猪肉、肠衣和午餐肉等动物源性食品中的10 种β-受体激动剂在定性测定的同时进行定量测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲酸（色谱纯0.45 μm有机相滤膜） 德国CNW公司；QuCHERs粉末包括：丙基乙二胺（primarysecondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、C18、MgSO4粉末 上海安谱科学仪器有限公司；β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶美国Sigma公司；水为去离子水。

标准品：克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、妥布特罗、氯丙那林、喷布特罗、西马特罗、非诺特罗以及苯乙醇胺A；内标物质：D9-克仑特罗、D3-沙丁胺醇、D6-莱克多巴胺、D5-苯乙醇胺A、D3-特步他林（纯度均大于98%） 德国DR.E公司。

标准储备液的配制：称取适量的上述标准品，分别用甲醇溶解定容至100 mL，溶液质量浓度为100 μg/mL，－18 ℃冰箱内避光保存。

工作溶液的配制：准确移取适量上述标准工作溶液以及其内标标准工作溶液，用试剂空白溶液配成适当质量浓度的标准曲线，其中克仑特罗质量浓度范围为0.05～0.5 ng/mL；其余9 种药物质量浓度范围为0.5～5 ng/mL，临用时现配。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪 日本资生堂公司；API4000 Q-Trap四极杆串联线性离子阱质谱仪（配备电喷雾电离（elaectrospray ionization，ESI）源） 美国AB Sciex公司；超声波发生器 德国Elma公司；涡旋混匀器 美国SI公司；离心机 美国Beckman公司；分析天平（感量0.000 1 g和0.01 g） 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取2 g（精确至0.01 g）猪肉、肠衣、午餐肉试样均质匀浆后置于50 mL塑料离心管中，加入15 mL乙酸铵缓冲溶液，50 μL β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶，37 ℃酶解过夜。酶解后的试样中加入5 种β-受体激动剂内标溶液，15 mL含体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀2 min，4 000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液。将100 mg PSA、25 mg GCB、150 mg C18、500 mg MgSO4全部加入上述提取液中，涡旋混匀5 min，取有机相，40 ℃减压蒸发至近干。1 mL乙腈-水（V∶V）溶液溶解残渣，过0.45 μm有机相滤膜，HPLC-q/LTQ-MS测定。

1.3.2 HPLC条件

色谱柱：Agilent XDB C18（4.6 mm×5.0 mm，1.8 μm）；流动相：A：含5 mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸的水溶液，B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序：0 min，95%A；2 min，50%A；3 min，1%A；9.5 min，1%A；10.0 min，95A%；15 min，95A%；流速：400 μL/min；进样量：20 μL；柱温：常温。

1.3.3 MS条件

电喷雾电压4 500 V；雾化气压力50 psi；气帘气压力30 psi；辅助气压力45 psi；离子源温度450 ℃。

当MRM信号域值大于IDA设定的1 000 cps时，同时启动线性条件：在上述质谱条件下增加IDA监测模式，监测响应值超过1 000最强的一个离子。建立增强离子扫描模式，扫描分子质量为50～400 D的离子，扫描速率为4 000 D/s。EPI电压参数：去簇电压（declustering potential，DP）100 V；碰撞气能量（collision energy，CE）45 V；扩展碰撞气能量（collision energy spared，CES）15 V。

1.3.4 LC-MS-MS谱库设置

分别用低、中、高3 种碰撞能量（30、45、60 eV）对10 种β-受体激动剂标准品进行EPI扫描，并用ACESS数据库编写10 种β-受体激动剂的液相色谱-串联离子阱的二级谱库，包括分子式、相对分子质量、CAS号、化学名及结构图等。

1.3.5 检测模式

MRM-IDA-EPI-谱库检索。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

采用β-盐酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酯酶酶解样品，将动物组织中蛋白质消解，使某些易和蛋白结合的待测物从细胞中的蛋白质结合状态下游离出来。采用0.2 mol/L的乙酸铵作为酶解缓冲液，使得在之后的提取步骤中，上层的乙腈层和下层水层由于盐析作用而较好地分层，有利于提取之后的浓缩。10 种β-受体激动剂类药物极性较强，采用乙腈溶液就可以较好地将这些药物残留提取出来，此外乙腈溶液有利于肉制品中蛋白质的沉淀，比较含体积分数1%乙酸-乙腈溶液和含体积分数1‰甲酸-乙腈溶液的提取效率，最终采取含体积分数1‰甲酸-乙腈溶液作为提取液。肉制品中脂肪含量较高，150 mg的C18粉末即可去除试样中的大部分脂肪。用25 mg GCB粉末除去肉组织中存在的部分色素，100 mg PSA粉末除去有机酸等杂质[21]，降低基质效应对检测结果的干扰。由于PSA粉末的效果取决于样品中的含水量，采用QuCHERs粉末净化过程中，加入无水硫酸镁，除去肉与肉制品中残余水分，有利于PSA粉末的净化。

2.2 HPLC和MS测定条件的比较

比较Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）和Thermo C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）对10 种β-受体激动剂的分离效果。结果表明，XDB-C18柱对上述药物的分离效果和峰形均较好，灵敏度较高。

采用质量浓度5 μg/mL上述10 种β-受体激动剂以及5 种内标标准溶液分别测定。在正离子模式下，进行母离子全扫描，确定分子离子，并优化DP、CE等参数条件，以达到最佳灵敏度（表1）。确定2 个子离子作为定性离子，并选择其中之一作为定量离子。

表1 10种β-受体激动剂及其内标物的质谱条件和保留时间Table1 Optimized spectrometric parameters and retention times of 10 kinds of agonists and their internal standards

2.3 EPI模式的特征

和普通的三重四极杆质谱仪相比，线性离子阱质谱能够阱集碎片离子，通过EPI模式能够提供高灵敏度的检测方式，继而通过谱库检索，达到同时定性定量的目的。采用MRM-IDA-EPI-谱库检索的多步模式，首先利用Q-Trap的线性离子阱功能，从MRM模式获得各个化合物的保留时间、峰高、峰面积、离子比率等信息，再通过EPI扫描获得二级质谱图，和已经建立好的谱库进行比较，可获得其相似度和反相似度的值。

猪肉加标样品中喷布特罗和标准溶液图谱中喷布特洛的相似度值（84.381）和反相似度（75.078）值均较高，同时，结合化合物的保留时间4.17 min辅助定性分析，在不需要对该样品重新进样条件下，实现对样品中喷布特罗的快速确证，简化定性分析流程（图1）。

图1 2 种模式（MRM）和（IDA）下，猪肉基质加标（0.5 g/kg）样品中妥布特罗的测定及EPI谱库检索Fig.1 Determination of tulobuterol in spiked pork (0.5 μg/kg) under both operation modes (MRM) and (IDA), and enhanced product ion (EPI) library search

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、相关系数、检出限和定量限

在本方法所确定的实验条件下，分别用溶剂空白配制标准溶液，在选定的条件下进行测定。克仑特罗的线性范围在0.05～0.5 ng/mL内、其余9 种β-受体激动剂的线性范围在0.5～5 ng/mL内，标准峰面积与内标峰面积的比值Y与对应的质量浓度比值X（μg/L）呈现良好线性关系，相关系数（r2）均大于0.99。在基质空白溶液中添加目标化合物，以特征离子色谱峰的信噪比RSN＞3确定为方法检出限，RSN＞10确定为方法定量限，克仑特罗的检出限为0.025 μg/kg，定量限为0.05 μg/kg；其余9 种β-受体激动剂的检出限为0.25 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg（表2）。

表2 10 种-受体激动剂的线性方程和相关系数Table2 Regression equations and correlation coefficients (r2) of 10 kinds of -agonists

2.4.2 方法回收率及精密度

表3 100 种β-受体激动剂添加回收率范围及精密度（n=6）Table3 Recoveriges and RSDs of 10 kinds ofβ-agonissttss (n=6)

图2 猪肉中添加0.05 μg/kg克仑特罗、0.5 μg/kg其余9 种β-受体激动剂的选择离子色谱图Fig.2 MRM chromatograms of pork spiked with 0.05 μg/kg clenbuterol and 0.5 μg/kg 9 other kinds of β-agonist standards

在本方法所确定的实验条件下，在猪肉、肠衣、午餐肉3 个基质中分别以l、2、4 倍执行限量水平进行添加，考察10 种β-受体激动剂的回收率和精密度，每个进行6 次重复实验。表3、图2结果表明，10 种药物在3 个基质中的平均回收率分别在85.6%～118.4%、85.6%～119.2%、80.4%～118.4%之间，相对标准偏差在1.47%～14.4%、2.45%～15.4%、1.04%～12.5%之间，符合残留检测的要求。

2.5 实际样品测定

以本方法对猪肉、肠衣、午餐肉的12 批实际样品进行测定，在两份猪肉样品中发现莱克多巴胺残留，残留量分别为2.14、8.47 μg/kg。

3 结 论

本方法前处理操作简便、精密度和准确度较高，分析时间短、净化效果好，可对猪肉、肠衣和午餐肉等动物源性食品中的10 种β-受体激动剂在定性测定的同时进行定量测定。

[1] 农业部第176号公告. 禁止在饲料和动物饮水中使用的物质[S].

[2] 农业部第1519号公. 禁止在饲料和动物饮水中使用的物质[S].

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Determination of 10 Kinds of β-Agoinsts in Meat and Meat Products by Matrix Solid-phase Dispersion-High Performance Liquid Chromatography Tandem Quadrupole Linear Ion Trap Mass Spectrometry

ZHANG Yi, ZHAO Shan-zhen*, QU Li, CAO Chen, SHI Yi-yin, YI Xiong-hai
(Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

A method based on matrix solid-phase dispersion-high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-q/LTQ-MS) for the determination of 10 kinds of β-agoinsts in meat and meat products was presented. Clenbuterol, salbutamol, ractopamine, tulobuterol, terbutaline, clorprenaline, penbutolol, cimaterol and fenoterol were extracted with acetonitrile, followed by a further clean-up procedure using QuEChERS method. A multiple reaction monitoring (MRM) as survey scan and an enhanced product ion (EPI) scan as dependent scan were performed in an information dependent acquisition (IDA) experiment. The identification of the compounds was carried out by library search with a precursor ion MS-MS library based on EPI spectra at three different collision energies in a positive mode. The results showed that clenbuterol was in the range of 0.05-0.5 ng/mL, and 9 other kinds of β-agoinsts residues were in the range of 0.5-5 ng/mL with correlation coefficients (r2) higher than 0.99. The limit of quantification was 0.05 μg/kg for clenbuterol and 0.5 μg/kg for 9 other kinds of β-agoinsts. The recoveries of spiked standards in pork, casing and luncheon meat ranged from 85.6% to118.4%, 85.6% to119.2%, and 80.4% to 118.4%, with relative standard deviation (RSD) of 1.47%-14.4%, 2.45%-15.4%, and 1.04%-12.5% (n = 6), respectively. This method can be used for simultaneous analysis of 10 kinds of β-agonists in meat and meat products.

β-agoinsts; matrix solid-phase dispersion; high performance liquid chromatography tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry (HPLC-q/LTQ-MS); me at and meat products

O657

A

1002-6630（2014）20-0202-06

10.7506/spkx1002-6630-201420040

2014-01-23

上海出入境检验检疫局科研项目（HK014-2014；HK008-2014）；国家质量监督检验检疫总局质检公益性行业科研专项（201110019-04；201310140-02）；国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ15055705）

张旖（1987—），助理工程师，学士，研究方向为食品安全。E-mail：693532054@qq.com

*通信作者：赵善贞（1983—），工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：zhaosz@shciq.gov.cn