超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化及脂肪酸组成分析

贾俊强，吴琼英，杜金娟，何荣海，桂仲争，颜 辉

超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化及脂肪酸组成分析

贾俊强1,2，吴琼英1,2，杜金娟1，何荣海3，桂仲争1,2，颜 辉1,2

（1.江苏科技大学生物技术学院，江苏 镇江 212018；2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏 镇江 212018；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

为开发蚕蛹油提取新工艺，以蚕蛹为原料，采用超声波辅助中性蛋白酶水解法提取蚕蛹油。在单因素试验的基础上，以蚕蛹油提取率为响应值，用响应面分析法研究超声功率、底物质量浓度和加酶量对蚕蛹油提取率的影响，并通过气相色谱对蚕蛹油的脂肪酸组成进行分析。结果表明：各因素对蚕蛹油提取率影响从大到小依次为：底物质量浓度、加酶量、超声功率。超声波辅助水解法提取蚕蛹油的最优工艺条件为：底物质量浓度68.2 g/L、超声功率121.6 W、加酶量2 849.4 U/g。在此条件下，蚕蛹油提取率为（90.2±0.66）%。气相色谱分析表明，超声波辅助水酶法与传统溶剂（正己烷）提取的蚕蛹油中脂肪酸组成与含量基本一致，均主要由棕榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸组成。

超声波；水酶法；蚕蛹油；脂肪酸组成

蚕蛹是缫丝工业的主要副产物，其产量约占蚕茧干质量的60%[1]。在我国，每年大约有50多万吨干蚕蛹产生[2]。据报道，蚕蛹中含量丰富的油脂，蚕蛹油在干蚕蛹中的含量约为300 mg/g，且不饱和脂肪酸含量高，高达66.8%，主要由α-亚麻酸、亚油酸类物质组成。这些不饱和脂肪酸对动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等疾病具有良好的辅助治疗作用[1,3]。因此，开展蚕蛹油脂深加工是我国蚕桑资源开发研究的热点领域之一。

油脂提取常用的主要方法有压榨法、有机溶剂浸提法、超临界CO2萃取法和亚临界萃取法等[4-7]。在这些油脂提取方法中，压榨法具有出油率低、劳动强度大、生产效率低、饼粕蛋白易变性等缺点，有机溶剂浸提法易引起毛油色泽深、有机溶机残留等问题，超临界CO2萃取和亚临界萃取法则具有设备昂贵、不易操作和批处理量小等不足之处[8]。水酶法是近年来开发出的油脂提取新技术，具有操作方便、无有机物残留、油料蛋白不易变性、易规模化生产等优点，已被广泛用于油料作物中油脂的提取，如：葫芦籽油[9]、南瓜籽油[10]、油茶籽油[11]、巴旦木油[12]、玉米胚芽油[13]、茶叶籽油[14]和牡丹籽油[15]等。迄今为止，利用水酶法提取蚕蛹油鲜见报道。本实验利用超声波辅助水酶法提取蚕蛹油，利用响应面法优化超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的工艺，并通过气相色谱，比较分析水酶法和传统有机溶剂提取法所得油脂中脂肪酸的组成，为蚕蛹油的开发利用提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕蛹由中国农业科学院蚕业研究所提供，在50 ℃烘干后用研钵研磨成粉末，过60 目筛后备用；中性蛋白酶（最适温度50 ℃、最适pH 7.0、酶活力50 U/mg） 江苏维赛科技生物公司；脂肪酸甲酯化标品 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ5200DB型超声波提取器 昆山市超声仪器有限公司；DHG-9143BS型电热鼓风干燥器 上海新苗医疗器械制造有限公司；H205DR-1型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；SSY-H型恒温水浴锅 上海三申医疗器械有限公司；7820A型气相色谱仪 德国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 蚕蛹油提取工艺流程

本实验以中性蛋白酶作为水解用酶，研究超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的工艺，具体工艺流程如下：

蚕蛹→粉碎→用蒸馏水配成悬浮液→置于超声波清洗槽中→水浴温度升至50 ℃→加入中性蛋白酶→开启超声波→提取结束后→离心→吸取油层→脱水→蚕蛹油。

1.3.2 蚕蛹油提取率计算

蚕蛹总脂肪质量测定参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》中的索氏抽提法。

提取率/%=提取 的蚕蛹油质量/蚕蛹总脂肪质量×100

1.3.3 蚕蛹油脂肪酸组成分析

1.3.3.1 蚕蛹油甲酯化处理

蚕蛹油甲酯化根据楼乔明等[16]报道的BF3-甲醇衍生法，略有修改。精确吸取20 mg蚕蛹油，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，充分振荡后于70 ℃水浴皂化90 min，冷却后加入5 mL 14% BF3-甲醇溶液于70 ℃水浴甲酯化90 min，冷却后，加入2 mL正己烷和2 mL饱和NaCl溶液，取上清液，用正己烷定容至5 mL，供气相色谱分析。

1.3.3.2 气相色谱分析

采用HP-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为氮气；氢火焰离子化检测器；柱流量1 mL/min；进样量1 μL；不分流模式；进样口温度270 ℃；升温程序：起始温度130 ℃保持1 min，以10 ℃/min升温到185 ℃，保持20 min，再以5 ℃/min 升温到220 ℃，然后以30 ℃/min升温到270 ℃，保持5 min。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助水酶法提取蚕蛹油工艺优化

在超声波作用下，采用中性蛋白酶降解蚕蛹中的蛋白质，使蚕蛹油释放出来，最后分离出蚕蛹油。研究单因素（超声功率、加酶量、酶解时间和底物质量浓度）对蚕蛹油提取率的影响，并通过响应面法确定最佳提取工艺条件。

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 超声功率对蚕蛹油提取率的影响

图1 超声功率对蚕蛹油提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of silkworm pupae oil

由图1可以看出，在中性蛋白酶酶解过程中施加超声波处理后，蚕蛹油的提取率明显高于未施加超声波组（功率0 W），且随着超声功率的增加，蚕蛹油提取率快速上升，在超声功率120 W时达到最高。这与超声波处理能够增加酶解底物与蛋白酶的碰撞频率有关[17]，酶解底物与蛋白酶碰撞频率的增加，导致了蚕蛹蛋白酶解反应加快，使油脂从蚕蛹组织中充分释放出来。当超声功率大于120 W时，蚕蛹油的提取率反而有所下降，原因可能是高功率超声波引起了中性蛋白酶活性部分丧失[18]，使酶解反应减慢，最终导致蚕蛹油提取率下降。

2.1.1.2 加酶量对蚕蛹油提取率的影响

在超声频率40 kHz、功率80 W、酶解温度50 ℃、酶解pH 7.0、酶解时间30 min和底物质量浓度50 g/L的条件下，研究不同加酶量对蚕蛹油提取率的影响，结果如图2所示。

图2 加酶量对蚕蛹油提取率的影响Fig.2 Effect of enzyme/substrate ratio on the extraction yield of silkworm pupae oil

由图2可知，蚕蛹油提取率与加酶量呈现正相关性，随着加酶量的增加，蚕蛹油提取率快速增加，这是由于加酶量增大引起蚕蛹蛋白水解程度增加，促进了蚕蛹油释放。当加酶量在2 500 U/g以上时，蚕蛹油提取率增幅变缓，这表明加酶量在2 500 U/g时，蚕蛹蛋白几乎已达到最大水解，提高加酶量对蚕蛹蛋白的水解程度影响不大，故油脂提取率变增幅不大，这一现象与加酶量对葫芦籽油提取率的作用结果基本一致，随着加酶量的增加，葫芦籽油提取率先迅速增加后趋于恒定[9]。

2.1.1.3 酶解时间对蚕蛹油提取率的影响

在超声频率40 kHz、功率80 W、酶解温度50 ℃、酶解pH 7.0、加酶量500 U/g和底物质量浓度50 g/L条件下，研究不同酶解时间对蚕蛹油提取率的影响，结果如图3所示。

注意公式（12）是基于振幅的方法，不同于基于标准到时的方法。采用这一方法的主要原因是发现，无震动信息是区分在时空上发生相近的多个地震事件的关键。这将在后面的讨论一节中进一步阐述。

图3 酶解时间对蚕蛹油提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of silkworm pupae oil

由图3可知，酶解时间对蚕蛹油提取率的影响较小，随着酶解的进行，蚕蛹油提取率缓慢增加，在酶解130 min时，蚕蛹油提取率为82.5%，仅比酶解30 min的蚕蛹油提取率（79.1%）提高了4.3%。原因可能是酶解30 min前，蚕蛹蛋白酶解反应速度快，加速了蚕蛹油释放，当酶解30 min以上时，酶解反应因底物减少以及产物抑制等因素使酶解反应达到平衡，蚕蛹油提取率增幅变缓[9]。

2.1.1.4 底物质量浓度对蚕蛹油提取率的影响

在超声频率40 kHz、功率80 W、酶解温度50 ℃、酶解pH 7.0、加酶量500 U/g和酶解时间30 min的条件下，研究不同底物质量浓度对蚕蛹油提取率的影响，结果如图4所示。

图4 底物质量浓度对蚕蛹油提取率的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on the extraction yield of silkworm pupae oil

由图4可知，随着底物质量浓度的增加，蚕蛹油的提取率先增后减，这与水酶法提取葫芦籽油[9]、橡胶籽油[19]和红花籽油[20]中底物质量浓度对油脂提取率的影响趋势基本一致。这主要因为随着底物质量浓度的增加，底物与蛋白酶接触频率增加，酶解反应速度加快，促使蛋白快速降解和油脂溶出；然而，当底物质量浓度过高时，则由于反应体系黏度增大，蛋白酶与底物接触反而受阻，酶解反应速度下降，蛋白降解和油脂的溶出受阻。

2.1.2 响应面法优化

在单因素试验基础上，固定酶解时间30 min，采用Box-Behnken设计原理，以蚕蛹油提取率为响应值，选取底物质量浓度、超声功率和加酶量进行三因素三水平的旋转正交试验设计。响应面试验的因素水平设计见表1。Box-Behnken设计方案共有15 次试验，试验结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

2.1.2.1 模型建立及显著性检验

表3 响应表面回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface model

采用Design Expert 7.1.3统计软件对表2试验数据进行多元回归拟合，建立油脂提取率（Y）与底物质量浓度（X1）、超声功率（X2）和加酶量（X3）之间的响应面回归模型为：Y=89.87-2.20X1＋0.70X2＋2.10X3＋0.43X1X2＋0.33X1X3＋0.08X2X3-5.37X12-2.12X22- 1.47X32（X1、X2、X3为各因素水平的编码数）。从表3可以看出，X1、X3、X12对蚕蛹油提取率的影响极显著（P＜0.01），对蚕蛹油提取率的影响较显著（P＜0.05），X2、X1X2、X1X3、X2X3和对蚕蛹油提取率的影响不显著（P＞0.05），表明提取率（Y）与底物质量浓度（X1）、超声功率（X2）和加酶量（X3）之间为非线性关系。另外，从表3也可以看出，各因素对蚕蛹油提取率影响大小顺序为：底物质量浓度（X1）＞加酶量（X3）＞超声功率（X2）。该模型回归极显著（P＜0.01），失拟项P=0.243 3，差异不显著（P＞0.05），并且该模型决定系数R2为95.15%，调整后决定系数R2Adj为86.42%，变异系数为1.68%，说明该模型拟合精确、可信，可用于分析和预测水酶法提取蚕蛹油的情况[21]。

2.1.2.2 最优工艺条件确定及验证

采用Design Expert 7.1.3统计软件作出底物质量浓度（X1）、超声功率（X2）和加酶量（X3）两两之间的响应面图见图5。

图5 各因素对蚕蛹油提取率影响的响应面Fig.5 Response surface for interactive effects of independent variables on the extraction yield of silkworm pupae oil

从底物质量浓度（X1）与超声功率（X2）对蚕蛹油提取率的响应面（图5a）可以看出，底物质量浓度与超声功率之间存在交互作用。随着底物质量浓度和超声功率的增加，蚕蛹油提取率逐渐升高，但当底物质量浓度和超声功率增加到一定值后，蚕蛹油提取率却随着底物质量浓度和超声功率的增加而下降。因此，在加酶量不变的情况下，底物质量浓度与超声功率对蚕蛹油提取率的响应面存在极值，在底物质量浓度65～70 g/L和超声功率120～125 W范围内，蚕蛹油提取率较大。

从加酶量（X3）与底物质量浓度（X1）对蚕蛹油提取率的响应面（图5b）可知，加酶量与底物质量浓度之间存在交互作用。随着底物质量浓度和加酶量的持续增加，蚕蛹油提取率先逐渐升高到一定值后，又呈下降的趋势。因此，在超声功率不变的情况下，加酶量与底物质量浓度对蚕蛹油提取率的响应面存在极值，在底物质量浓度65～70 g/L和加酶量2 500～3 000 U/g范围内，蚕蛹油提取率较大。

从超声功率（X2）与加酶量（X3）对蚕蛹油提取率的响应面可知（图5c），超声功率与加酶量之间存在交互作用。随着超声功率与加酶量的增加，蚕蛹油提取率先增后减。在底物质量浓度不变的情况下，超声功率与加酶量对蚕蛹油提取率的响应面也 存在极值，在超声功率115～125 W和加酶量2 500～3 000 U/g范围内，蚕蛹油提取率较大。

综上所述，由于底物质量浓度（X1）、超声功率（X2）和加酶量（X3）两两之间的响应面均存在极值。因此，可以通过对二次回归的数学模型取一阶偏导获得最优试验条件[22-23]，确定X1=-0.176 95，X2=0.160 33，X3=0.698 79；最终得到最优蚕蛹油提取条件为：底物质量浓度68.2 g/L，超声功率121.6 W，加酶量2 849.4 U/g。在此条件下，蚕蛹油提取率预测值为90.9%，对以上最优提取条件进行验证实验，经3 次平行实验，蚕蛹油提取率分别为90.8%、89.5%、90.3%，平均值为（90.2±0.66）%。验证结果与理论预测值接近。表明预测值和真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

2.2 超声波辅助水酶法提取的蚕蛹油脂肪酸组成分析

为了研究水酶法提取对蚕蛹油脂肪酸组成的影响，以传统有机溶剂提取的蚕蛹油为对照，利用气相色谱分析蚕蛹油中的脂肪酸组成（图6），利用面积归一法获得蚕蛹油中各脂肪酸的相对含量如表4所示。由表4可知，水酶法与正己烷提取的蚕蛹油的脂肪酸组成基本一致，无明显不同，均主要含有棕榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸。亚油酸和亚麻酸为人体必需脂肪酸，不仅具有极高的营养价值而且具有良好的药理功能[24-25]。与正己烷提取相比，通过超声波辅助水酶法提取的蚕蛹油不仅不饱和脂肪酸含量略高，且色泽亮黄，气味纯正。另外，超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的操作方便，易于工业化生产，因而具有潜在的应用前景。

图6 不同方法所得蚕蛹油甲酯化的气相色谱图Fig.6 GC chromatograms of methyl esters of silkworm pupae oils obtained by different extraction methods

表4 不同方法所得蚕蛹油脂肪酸的相对含量Table 4 Relative contents of fatty acids of silkworm pupae oils obtained by different extraction methods

3 结 论

3.1 采用响应面分析法优化了超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取蚕蛹油的工艺，各因素对蚕蛹油提取率影响的大小依次为底物质量浓度＞加酶量＞超声功率；确定最优工艺条件为底物质量浓度68.2 g/L、超声功率121.6 W、加酶量2 849.4 U/g，在此条件下，蚕蛹油提取率为（90.2±0.66）%。

3.2 超声波辅助水酶法与正己烷提取的蚕蛹油中脂肪酸组成与含量基本一致，均主要含有棕榈油酸、软脂酸、亚麻酸、亚油酸、油酸和硬脂酸；因此，超声波辅助水酶法是一种绿色、高效和安全的提取油脂方法，具有潜在的应用前景。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Aqueous Enzymatic Extraction and Fatty Acid Composition of Silkworm Pupae Oil

JIA Jun-qiang1,2, WU Qiong-ying1,2, DU Jin-juan1, HE Rong-hai3, GUI Zhong-zheng1,2, YAN Hui1,2
(1. School of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China; 2. Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China; 3. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

As a new extraction technique, ultrasonic-assisted neutral protease hydrolysis (UANPH) was used to extract oil from silkworm pupae. On the basis of single factor experiments, effects of ultrasonic power, substrate concentration and enzyme dosage on the extraction yield of silkworm pupae oil were studied with response surface methodology. In addition, the fatty acid composition of silkworm pupae oil was analyzed by gas chromatography (GC). The results showed that the the extraction yield of silkworm pupae oil was affected in decreasing order by substrate concentration, enzyme dosage and ultrasonic power. The optimized operating parameters were as follows: substrate concentration 68.2 g/L, ultrasonic power 121.6 W and enzyme dosage 2 849.4 U/g. Experiments carried out under the optimal conditions led to an extraction yield of (90.2 ± 0.66)%. GC analysis showed that composition and contents of fatty acids in silkworm pupae oils by UANPH extraction and traditional solvent (n-hexane) extraction were in substantial agreement. The silkworm pupae oils were mainly composed of palmitoleic acid, palmitic acid, linolenic acid, linoleic acid, oleic acid and stearic acid.

ultrasound; aqueous enzymatic extraction; silkworm pupae oil; fatty acid composition

TS224.4

A

1002-6630（2014）16-0052-06

10.7506/spkx1002-6630-201416010

2013-10-31

江苏省自然科学基金项目（BK2012693；BK2012708）；公益性行业（农业）科研专项（201403064）

贾俊强（1973—），男，副研究员，博士，研究方向为生物资源开发与利用。E-mail：junqiangjia2008@163.com