黄连解毒汤对小鼠S180肉瘤血管生成抑制作用的试验研究

孙 燕，万 冰，金 戈，张玉丽，郭 丽，马铃铃，张梦月

（1.沈阳医学院基础医学院，沈阳 110034；2.沈阳医学院附属中心医院检验科，沈阳 110024；3.辽宁何氏医学院形态学教研室，沈阳 110163）

黄连解毒汤对小鼠S180肉瘤血管生成抑制作用的试验研究

孙 燕1，万 冰2，金 戈1，张玉丽3，郭 丽1，马铃铃1，张梦月1

（1.沈阳医学院基础医学院，沈阳 110034；2.沈阳医学院附属中心医院检验科，沈阳 110024；3.辽宁何氏医学院形态学教研室，沈阳 110163）

研究黄连解毒汤（HLJDT）对肿瘤生长的抑制作用及其对肿瘤组织COX-2、VEGF、bFGF的影响。将健康雌性昆明种小鼠50只（体重18～22 g）随机分为对照组，环磷酰胺组（CTX），黄连解毒汤大、中、小剂量组（22.0、11.0、5.5 g·kg-1）。通过皮下注射S180细胞悬液建立小鼠S180肉瘤模型，观察抑瘤率，并采用免疫组化的方法研究黄连解毒汤对肿瘤组织COX-2、VEGF、bFGF的作用。结果表明，黄连解毒汤大剂量组对小鼠S180肉瘤具有明显的抑制作用，免疫组化染色显示黄连解毒汤各剂量组对肿瘤组织中COX-2、bFGF表达有明显抑制作用，同时大、中剂量组对VEGF表达有明显抑制作用。说明黄连解毒汤对S180肉瘤具有抑制作用，其可抑制肿瘤组织中血管生成相关因子COX-2、VEGF、bFGF的表达，抑制肿瘤血管生长，抑制肿瘤生长，抗血管生成可能是其发挥治疗作用的另一种机制。

黄连解毒汤；S180；环氧合酶-2；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子

恶性肿瘤是人类主要的死亡原因之一。研究表明，新生血管生成是肿瘤生长及转移的必要条件，肿瘤的无限制生长、侵袭和转移均依赖于血管生成[1-2]。Folkman提出可以通过抑制血管生成治疗恶性肿瘤[3]。目前抗血管生成治疗已成为临床肿瘤治疗的重要方法之一。

黄连解毒汤（HLJDT），由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，具有泻火解毒、凉血止血之功效。该方有抑制恶性肿瘤作用，临床用于治疗胰腺癌、乳腺癌、肝癌和大肠癌[4-5]。但黄连解毒汤抗肿瘤机制研究较少，主要集中在影响细胞增殖能力、诱导细胞凋亡、增强免疫功能等方面[6-9]。本文在前期研究基础上，采用S180移植性肿瘤模型，观察HLJDT对S180肿瘤的抑制作用，观察其对肿瘤组织内环氧化酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达影响，进一步探讨其抑瘤作用与抗血管生成的关系，促进黄连解毒汤抗肿瘤机制研究深化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

黄连解毒汤：黄连、黄芩、黄柏、栀子均购自沈阳市药材公司，经鉴定为正品；阳性对照药环磷酰胺（CTX），购自通化茂祥制药有限公司，批号120301；COX-2一抗、VEGF一抗、bFGF一抗，Santa Cruz产品；超敏S-P（鼠/兔）试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 动物与瘤株

健康雌性昆明种小鼠，体重18～22 g由沈阳药科大学实验动物中心提供，动物合格证号：辽实动字（2000）第042号。

腹水型S180瘤株购自于吉林省肿瘤研究所。

1.1.3 仪器

LD2-A低速离心机由北京医用离心机厂生产；赛多利斯BS124S电子天平由上海精密仪器公司生产；PM-10AD倒置相差显微镜由日本Olym⁃pus公司生产；LEICA CM1800冰冻切片机由德国Leica公司生产；moticcam3000显微摄影成像系统由美国motic公司生产。

1.2 方法

1.2.1 HLJDT药液制备

黄连、黄芩、黄柏、栀子按原方比例（3∶2∶2∶3）煎煮2次，分别加10倍、8倍的水煎煮60、40 min，合并煎煮液，浓缩至含生药1.4 g·mL-1，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 瘤株移植方法

S180腹水瘤细胞株经昆明种小鼠腹腔移植传代，取传代7 d的小鼠，无菌操作，从腹腔抽取腹水瘤细胞液，用生理盐水调至1×107·mL-1，每只小鼠于右前腋下接种0.2 mL。

1.2.3 动物分组及给药

取健康雌性昆明种小鼠50只（体重18～22 g），接种后随机分为5组，每组10只，灌胃给药。分别为对照组，即生理盐水（NS），用量20 mL·kg-1；环磷酰胺组（CTX），用量25 mg·kg-1；HLJDT大、中、小剂量组，22.0、11.0、5.5 g·kg-1。HLJDT大、中、小剂量组分别相当于60 kg成人日用量的4、2、1倍。接种次日开始给药，每日1次，CTX组小鼠体重减轻后改为隔日给药，用药7 d。

1.2.4 取材、冰冻切片、免疫组化染色

用药后第7天，各组小鼠均于末次给药后1 h进行以下试验：称重后，颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块，精密电子天平称重并记录。新鲜的肿瘤组织做冰冻切片，厚8 μm，用于COX-2、VEGF、bFGF免疫组化，步骤按说明书进行，COX-2、VEGF、bFGF一抗均为1∶100稀释。

1.3 观察指标

1.3.1 抑瘤率

抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.3.2 肿瘤组织内COX-2、VEGF、bFGF免疫组化测定

COX-2、VEGF、bFGF免疫组化染色评分标准按Rahman等方法进行[10]，即评分标准是：分值高低等于着色细胞比例评分（染色范围）+染色的强度评分，染色范围（阳性细胞比率）分为0～4级：0分-阴性；1分-阳性细胞1%～25%；2分-阳性细胞26%～50%；3分-阳性细胞51%～75%；4分-阳性染色76%～100%。染色强度标准划分为0～3级：0分-阴性；1分-弱阳性；2分-中等强度；3分-强阳性。各组差异显著性检验采用t检验，检验水准为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 抑瘤率

表1结果表明，环磷酰胺组与HLJDT大剂量组对小鼠S180肉瘤具有明显的抑制作用，HLJDT中、小剂量组瘤重虽有下降趋势但未达到显著性水平。HLJDT大剂量组抑瘤率与CTX组接近。

2.2 HLJDT对S180肿瘤组织中COX-2、VEGF、bFGF表达的影响

免疫组织化学染色显示，COX-2蛋白阳性染色定位于肿瘤细胞胞质靠近核膜部位，对照组S180肿瘤细胞COX-2呈高表达。与对照组比较，CTX对S180肿瘤组织中的COX-2表达有一定抑制作用。HLJDT对COX-2抑制作用显著，大、中、小剂量组均可使COX-2表达下降，且差异显著。说明HLJDT确实可降低肿瘤组织COX-2的活性。结果见图1，表2。

免疫组织化学染色显示，VEGF主要定位于S180肿瘤细胞的细胞质，且在S180肿瘤组织中呈高表达。与对照组比较，CTX对VEGF表达无明显影响，而HLJDT小剂量组有降低VEGF表达的趋势，但差异无显著，大、中剂量组对VEGF表达有明显抑制作用，差异显著。说明HLJDT可使VEGF表达下降。结果见图2，表2。

表1 HLJDT对S180肉瘤小鼠实体瘤的抑制作用(±SD，n=10)Table 1 Effect of HLJDT on the mice implanted with S180tumor(±SD，n=10)

表1 HLJDT对S180肉瘤小鼠实体瘤的抑制作用(±SD，n=10)Table 1 Effect of HLJDT on the mice implanted with S180tumor(±SD，n=10)

注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。下同。Note：*P＜0.05,**P＜0.01 compared with control group.The same as below.

表2 HLJDT对S180肉瘤COX-2、VEGF及bFGF的影响(±SD，n=10)Table 2 Effects of HLJDT on S180tumor cyclooxygenase-2(COX-2),vascular endothelial growth factor(VEGF)and basic fibroblast growth factor(bFGF)(±SD，n=10)

表2 HLJDT对S180肉瘤COX-2、VEGF及bFGF的影响(±SD，n=10)Table 2 Effects of HLJDT on S180tumor cyclooxygenase-2(COX-2),vascular endothelial growth factor(VEGF)and basic fibroblast growth factor(bFGF)(±SD，n=10)

图1 环氧化酶-2免疫组化染色(×400)Fig.1 Immunohistochemical stain of cyclooxygenase-2(COX-2)(×400)

图2 血管内皮生长因子免疫组化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical stain of vascular endothelial growth factor(VEGF)(×400)

免疫组织化学染色显示，bFGF主要定位于S180肿瘤细胞的胞质，且在S180肿瘤组织中也呈高表达。与对照组比较，CTX对bFGF表达有一定抑制作用。HLJDT大、中、小剂量组bFGF表达均低于对照组，且差异显著结果，尤其是大、中剂量组，差异极显著。结果见图3，表2。

图3 碱性成纤维细胞生长因子免疫组化染色(×400)Fig.3 Immunnohistochemical stain of basic fibroblast growth factor(bFGF)(×400)

3 讨论与结论

肿瘤生长须依赖持续和广泛的血管生成，因此，肿瘤的新生血管已成为抗肿瘤治疗的新靶点。天然药物中，很多药物己被证明具有抗肿瘤血管生长作用，如人参皂甙Rg3、鲨鱼软骨提取物等已被证实对新生血管形成有明显的抑制作用。一些具有抗肿瘤血管生成的中药单体或成分还处于研发过程中。加大抗肿瘤血管生成中药研究力度，对于肿瘤临床研究治疗及中药开发研究具有重要意义。

本研究中，发现HLJDT大剂量组对小鼠S180肉瘤具有明显抑制作用，抑瘤率与CTX组接近。且从试验观察中发现，HLJDT大剂量组小鼠生存质量优于CTX组，说明HLJDT在抑制肿瘤同时可改善荷瘤小鼠生存质量[11]。可能抵抗S180肿瘤对机体消耗作用。因此，HLJDT除可用于肿瘤治疗外，还有可能用于某些肿瘤临床辅助化疗。

环氧化酶是花生四烯酸或其他二十碳脂肪酸转化为前列腺素的关键限速酶，目前已知细胞中至少有两种COX同工酶：COX-1和COX-2。近年研究表明，COX-2与肿瘤发生具有明显关系[12]。本研究发现，COX-2在S180肿瘤组织也呈高表达，HLJDT大、中、小剂量组均可使COX-2表达显著下调。说明HLJDT在抑制肿瘤生长的同时，对S180肿瘤组织COX-2表达也有明显的抑制作用。

VEGF可增加血管通透性，在肿瘤发生、生长、转移中起重要作用[13-15]。VEGF在健康成人组织中维持正常的基本渗透功能和血管密度，以利于营养物质的运输，但其表达水平极低。VEGF通过刺激血管新生促进肿瘤细胞的生长和转移，是目前所知的作用最强、选择性最高的内皮细胞丝裂原，被认为是肿瘤组织中促血管生成的最主要血管生长因子。本研究表明，HLJDT大、中剂量组对VEGF表达有明显的抑制作用，说明抗血管生成可能是HLJDT抗肿瘤作用另一重要机制。

bFGF是强有力的促血管生成剂，也是多种细胞的促有丝分裂素之一，在血管形成的调控中起关键作用，可直接诱导血管生成，能通过自分泌和旁分泌形式促进肿瘤的生长与转移[16]。本研究表明，HLJDT大、中、小剂量组均可抑制S180肿瘤组织中bFGF表达，证明HLJDT可通过抑制血管生长而抑制肿瘤生长。由于COX-2可诱导VEGF及bF⁃GF等血管新生因子，促使肿瘤血管新生，因此HLJDT抗血管生成作用，可能是通过抑制COX-2的表达使VEGF及bFGF表达下调，抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤生长，需要进一步试验研究证实。

综上所述，HLJDT具有明显的抗血管生成作用，抑制肿瘤的生长，是HLJDT抗肿瘤的重要机制。HLJDT抗肿瘤药理作用的深入研究，有助于开发高效的血管生成抑制剂，用于与血管生成密切相关的恶性肿瘤临床治疗。

[1]Folkman J.Clinical complications of research on angiogenesis[J]. N Engl J Med,1995,333(26)∶1757-1763.

[2]Rong X Y,Yang D,Jiang Y X.Correlation between contrast en⁃hanced power doppler and pathology in quentitative vascularity of breast masses[J].Chin J Med Imaging Technol,2002,18(7)∶660-663.

[3]Folkman J.Anti angiogenesis∶a new concept for therapy of solid tumors[J].Ann Surg,1972,175(3)∶409-416.

[4]钱伯文.肿瘤的辨证施治[M].上海∶上海科学技术出版社, 1980∶81.

[5]常敏毅.实用抗癌方剂[M].北京∶中国医药科技出版社,1998∶197.

[6]孙健,温庆辉,宋宇,等.黄连解毒汤抗肿瘤作用的实验研究[J].中国中药杂志,2006,31(17)∶1461-1463.

[7]孙付军,宋卫国,李贵海,等.黄连解毒汤70%醇提物对MDR模型小鼠S180肿瘤细胞凋亡因子表达的影响[J].中华中医药杂志,2010,25(4)∶610-612.

[8]李秋柏,游泳,陈智超,等.黄连解毒汤抑制多发性骨髓瘤RP⁃MI8226细胞增生及促凋亡作用的研究[J].白血病·淋巴瘤, 2006,15(6)∶412-415.

[9]周阿高,张勇,孔德云,等.黄连解毒汤对荷瘤小鼠免疫调节作用的实验研究[J].中国实验方剂学杂志,2007,13(3)∶56-58.

[10]Rahman A,Dhar D K,Yamaguchi E,et al.Coexpression of induc⁃ible nitric oxide synthase and COX-2 in hepatocellular carcino⁃ma and surrounding liver[J].Clin Cancer Res,2001,7(5)∶1325-1332.

[11]孙燕,王俊平,张玉丽,等.黄连解毒汤对小鼠S180移植性肿瘤的抑制作用[J].东北农业大学学报,2013,44(9)∶63-68.

[12]Masferrer J L,Leahy K M,Koki A T,et al.Antiangiogenic and an⁃titumor activities of cyclooxygenase-2 inhibitors[J].Cancer Res, 2000,60(5)∶1306-1311.

[13]Robert Roskoski Jr.Vascular endothelial growth factor(VEGF) signaling in tumor progression[J].Critical Reviews in Oncology/ Hematology,2007,62(3)∶179-213.

[14]Sharif M R,Shaabani A,Mahmoudi H,et al.Association of the se⁃rum vascular endothelial growth factor levels with benign prostate hyperplasia and prostate malignancies[J].Nephro Urol Mon,2014, 6(3)∶e14778.

[15]Botelho F,Pina F,Silva P,et al.Vascular endothelial growth fac⁃tor(VEGF)and prostate pathology[J].Int Braz J Urol,2010,36(4)∶430-438.

[16]徐朝健,吕智审.血管抑素、bFGF与骨肉瘤血管形成[J].中国骨肿瘤骨病,2006,5(2)∶114-119. a bacterium specifically adapted to toxic metals∶Towards a catalogue of metal-responsive genes[J].FEMS Microbiology Reviews, 2003,27(2/3)∶385-410.

Experimental study of Huanglianjiedu decoction on inhibiting S180 sarcoma angiogenesis mice

SUN Yan1,WAN Bing2,JIN Ge1,ZHANG Yuli3,GUO Li1,MA Lingling1,ZHANG Mengyue1(1.Department of Basic Medical,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China;2.Laboratory Medicine of Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024,China;3.Department of Morphological,HE Medical University,Shenyang 110163, China)

The experiments were designed to study the effects of Huanglianjiedu Decoction(HLJDT) on antitumor activityin vivoand the expressions of COX-2,VEGF and bFGF in tumor tissues.50 healthy female Kunming mice(18-22 g)were collected,50 tumor-bearing mice were randomly divided into NS control group,CTX positive group and 22.0,11.0,5.5 g·kg-1HLJDT groups.We established S180model of mice by transplanting 0.2 mL S180cell suspension subcutaneously in mice,and immunohistochemical method was used to detect the expressions of COX-2,VEGF and bFGF.The results showed that the tumor-suppressing rate was higher in CTX group and HLJDT high dose group.COX-2 and bFGF in HLJDT groups and CTX group was lower than that in model group significantly.And the expressions of VEGF in HLJDT medium dose group and high dose group were markedly lower than that in model group.The results suggested that HLJDT had inhibitory effects on S180,and it also decreased the expression of COX-2,VEGF,bFGF in tumor tissue.Accordingly antiangiogenesis may be another mechanism for HLJDT to exert its treatment effects.

Huanglianjiedu Decoction(HLJDT);S180;COX-2;VEGF;bFGF

R285

A

1005-9369（2014）12-0031-05

时间2014-12-29 9∶05∶55 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.0905.013.html

孙燕,万冰,金戈,等.黄连解毒汤对小鼠S180肉瘤血管生成抑制作用的试验研究[J].东北农业大学学报,2014,45(12):31-35.

Sun Yan,Wan Bing,Jin Ge,et al.Experimental study of Huanglianjiedu decoction on inhibiting S180sarcoma angiogenesis mice[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):31-35.(in Chinese with English abstract)

2014-02-15

沈阳医学院科技基金项目（20133054）

孙燕（1979-），女，讲师，博士，研究方向为中药药理。E-mail：inksun@163.com