HPLC 法筛查中药软膏制剂中非法添加的17 种糖皮质激素

潘 军

(滨州市食品药品检验检测中心，山东 滨州256618)

糖皮质激素(Glucocorticoid)是一类具有孕甾烷基本母核，通常同时具有17-α 羟基和11-氧(羟基或氧代)取代的化合物［1］。糖皮质激素与糖、脂肪、蛋白质的代谢和生长发育等有着密切的关系，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。由于糖皮质激素类药物多数具有明显的抗炎作用，又可以透过表皮到达皮下血管发挥作用。在商业利益的驱使下，近年来出现了一些在中药软膏制剂中添加糖皮质激素类药物，而在药品说明书中却不加以注明的非法制剂。由于糖皮质激素本身具有一些影响水、盐代谢的副作用［2］，与其他药物合用还会出现许多不良反应［3-6］，长期使用会对患者的身体健康造成损害［7］。

目前应用于检测糖皮质激素类药物的方法较多［8-12］，但国内外文献中适合用于快速筛查的方法较少［13-14］，本实验对17 种常见的、可能用于非法添加的糖皮质激素类药物进行了研究，建立了可同时检测17 种糖皮质激素类非法添加物的快速筛查方法。本方法操作简单，可以使用混合对照品溶液，对仪器设备要求较低，适合在配置有二极管阵列检测器HPLC 的移动快检车内操作。适用于基层药检工作人员在现有条件下对市场上的中药制剂进行筛查，对制假售假和非法添加的行为予以打击，进一步保证人民群众的用药安全。

1 实验部分

1.1 仪器与试药 Agilent1260 高效液相色谱仪(四元低压，DAD 检测器，Chemstation C01.04 色谱工作站)，乙腈 (色谱纯，TEDIA，批号1203366)，重蒸蒸馏水(自制)，甲酸(分析纯，天津市博迪化工有限公司，批号121001)，对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号见表1。

表1 通常用于非法添加的糖皮质激素类药物Tab.1 Common glucocorticoids adulteration in herbal ointments

1.2 色谱条件 Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);以0.1%甲酸的水溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，梯度洗脱(0 ～15 min，30%B;15 ～30 min，30% ～60%B，30 ～32 min，60%B);体积流量1 mL/min;柱温箱温度35.0 ℃;检测器波长范围190 ～400 nm，带宽4 nm;进样量20.0 μL;分析时间为32 min;后运行时间10 min。

分别取17 种对照品溶液连续进样5 次，17 种成分色谱峰的峰面积的RSD 均小于0.4%，保留时间RSD 均小于0.4%，17 种药品色谱峰的理论板数均大于10 000。17 种糖皮质激素的色谱图见图1。结果表明精密度良好，柱效满足分析要求。

1.3 样品制备

1.3.1 对照品溶液的制备 分别称取17 种糖皮质激素对照品，用乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)溶解，并稀释至含对照品10 μg/mL 的溶液，作为对照品溶液。

图1 17 种糖皮质激素的色谱图Fig.1 Chromatograms of 17 kinds of glucocorticoids

1.3.2 供试品溶液制备 取试样0.5 g，加乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)适量，超声10 min 使样品溶解并定容至50 mL (若样品难溶，可水浴中适当加热并振摇使软膏融化，放冷后取水相层)，0.45 μm微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。

1.4 方法学验证试验

1.4.1 专属性 本次实验选用了华佗膏(上海松华药业有限公司生产，批号121005)、参皇软膏(吉林吉春制药股份有限公司生产，批号121028)、蟹黄肤宁软膏(山东明仁福瑞达制药有限公司生产，批号13501009)、冰黄肤乐软膏(西藏芝芝药业有限公司生产，批号130802)、丹皮酚软膏(合肥立方制药股份有限公司生产，批号20130614)、丹皮酚软膏(吉林吉春制药股份有限公司生产，批号130763)、复方片仔癀软膏(漳州片仔癀药业股份有限公司生产，批号130203)作为阴性样品，按“1.3.2”项下供试品溶液的制备方法，制备阴性样品及分别含有17 种目标成分的阳性样品的供试品溶液。用上述分析条件进行实验，结果阳性样品均检出目标成分，阴性样品无干扰。阴性样品和阳性对照的色谱图见图2。

图2 阴性样品和阳性对照色谱图Fig.2 Chromatograms of negative sample and positive reference sample

1.4.2 线性关系考察 分别取对照品溶液1、2、4、8、20 μL 进样，其他分析条件按照“1.2”项中的参数测定，以进样量(μL)为横坐标(X)，对照品峰面积积分值为纵坐标(Y)进行线性回归，相关系数r 均不低于0.99 (n =5)，表明17种糖皮质激素类药物在0.5 ～10 μg/mL 质量浓度范围内线性关系满足筛查需求。

1.4.3 回收率试验 在阴性样品中添加17 种糖皮质激素对照品，添加水平为0.1、0.5、1 mg/g，用本方法平行测定5 次。17 种激素的平均回收率在71% ～106%之间，RSD 均小于5%，结果表明，本方法准确度能够满足快速筛查的需要。

1.4.4 检测限 按信噪比(S/N)为3 时计算，17 种糖皮质激素类非法添加物的检测限均在30 μg/mL以下;按信噪比(S/N)为10 时计算，17 种糖皮质激素类非法添加物的定量限均在100 μg/mL 以下。

1.5 光谱特征 本实验中的17 种糖皮质激素色谱峰峰顶的光谱吸收图比较类似且特征明显，在190 ～400 nm 范围内只有1 处最大吸收，且最大吸收波长范围均在241 ～24 6 nm。

2 讨论

2.1 非法添加化学药品要保证其有效性，必须保证添加物的浓度达到药物的起效浓度，因此添加化学物质的浓度通常较高，容易被分析仪器检出。考虑到糖皮质激素类药物局部外用的临床治疗质量浓度多为0.1 ～2.5 mg/mL［15］，因此本实验在对照品溶液的选择上采用了10 μg/mL。

2.2 在流动相的选择上，本实验中有9 种糖皮质激素为酯化衍生物，在流动相中加入少量的酸可增加被检测物质的稳定性。乙腈在紫外区的截止波长范围优于甲醇，所以选择了乙腈作为有机相，0.1%甲酸作为水相的流动相组成。

2.3 本实验采用了配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪，在色谱峰达到较好分离的基础上，可以利用光谱吸收进行初步定性。本实验中17 种糖皮质激素光谱图比较简单且特征明显，在保留时间和光谱吸收均一致的情况下，假阳性的出现概率是非常低的。

2.4 由于存在某些化学物质与本实验中的17 种糖皮质激素色谱峰保留时间和光谱吸收相似的可能性，本方法适用于快速筛查，必要时需要用LC-MS和NMR 等设备进行进一步的确认，避免假阳性的判断。

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