野鸦椿籽不同极性提取物抗菌作用研究

罗李娜， 向德标， 胡乔铭， 裴 刚

(湖南中医药大学中药化学教研室，湖南 长沙410208)

野鸦椿Euscaphis japonica 为省沽油科Staphyleaceae 野鸦椿属Euscaphis 落叶灌木，野鸦椿籽为其干燥果实［1］。野鸦椿籽有温中理气，消肿止痛，祛风除湿之效［2］。据《湖南药物志》载:野鸦椿籽治寒疝肿痛、睾丸肿、脱肛、子宫脱垂。《四川中药志》载:野鸦椿籽性微温，味苦，无毒，可治月瘕、月经不调、膀胱疝气、痢疾泄泻。《福建药物志》载: “果治头痛，眩晕，感冒，荨麻疹，漆过敏，疝气;根治风湿，腰痛，胃痛，产后风。在福建南平地区，民间常用野鸦椿籽水煎液用于产妇产褥感染所致的发烧及炎症的治疗。据不完全统计，全球每年至少导致75 000 名产妇死亡，发展中国家由于卫生条件和治疗技术较落后，成为了产褥热的高发区［3］，产褥感染主要致病菌为甲型链球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、肺炎双球菌等［4-5］。早在19 世纪晚期，Louis Pasteur 发现并提出产褥感染主要是由链球菌引起的［6］。赵宏伟等［7］研究表明，乙型溶血性链球菌是链球菌中致病性最强的一种，可引起各种化脓性炎症、产褥热。为此，本实验研究野鸦椿籽不同极性部位提取物对临床分离的菌株和常见致病菌的抑制作用，通过体外活性筛选抑菌实验，从抑菌活性的角度出发，为寻找天然药物中抑菌的成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材 野鸦椿籽，采于福建省南平，经鉴定为省沽油科植物野鸦椿Euscaphis japonica 的干燥果实。

1.2 供试菌种 金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，甲型溶血性链球菌，乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌，均由湖南中医药大学医学基础微生物与免疫学教学实验中心惠赠。

1.3 培养基 营养琼脂(杭州微生物试剂有限公司生产，批号20110823-02);营养肉汤(杭州微生物试剂有限公司生产，批号20110926-05);血琼脂平板(郑州安图绿科生物工程有限公司，批号20121211);小牛血清(杭州四季青公司，批号9610003)。

1.4 仪器设备 立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂)，隔水式电热恒温培养箱 (GNP-9160BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司)。

2 实验方法与结果

2.1 耐药菌株的筛选 采用琼脂平板法［8］，参照武雪芬［9］的方法判断结果。

2.2 不同极性提取物的制备 分别称取2 份干燥粉碎野鸦椿籽，每份400 g。一份置于圆底烧瓶中，加水回流提取3次，每次加水1 000 mL 回流提取2 h，合并提取液，浓缩至小体积，加入无水乙醇至乙醇体积分数为80%，静置24 h，过滤沉淀，母液浓缩干燥，分别得到水提醇沉物51.3 g，水提醇沉液浓缩物23.8 g;另一份野鸦椿籽置于圆底烧瓶中，加70%乙醇回流提取3 次，每次加乙醇1 000 mL，回流提取2 h，合并提取液，回收乙醇，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，分别得二氯甲烷萃取物15.3 g，乙酸乙酯萃取物32.2 g，正丁醇萃取物18.5 g，水溶物9.3 g。临用前将不同极性部位低温冷冻干燥成粉末，分别取2.4 g，溶于30 mL 适当溶剂配制成80 mg/mL 的溶液。

2.3 培养基的制备 营养琼脂培养基经高压灭菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷却至60 ℃时倒入培养皿中，制备平板培养基，备用;营养肉汤培养基经高压灭菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷却，备用。

2.4 菌悬液的制备 将所有供试菌株分别接种于营养琼脂平板上，置37 ℃恒温培养箱培养24 h 活化，待用。挑取琼脂平板上形态相同的菌落，用灭菌生理盐水校正菌液浓度，再用营养肉汤稀释至含菌量约107CFU/mL。稀释后的菌液在15 min 内接种，备用。

2.5 MIC 的测定［10］取灭菌小试管11 支为一组，其中每组第11 支为阴性对照。每支试管分别加入营养肉汤2 mL。配制野鸦椿籽不同极性提取物原液质量浓度为80 mg/mL。用吸管吸取药液1 mL 放入第1 管内，混匀后吸取1 mL 放入第2 管，同样混匀后吸出1 mL 放入第3 管。依此二倍稀释法［11］逐管进行稀释至第10 管。各管药质量物浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 mg/mL，未达到抑菌质量浓度按原液质量浓度一倍增加或者一倍稀释。各管均加入菌液0.1 mL，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出，观察生长情况。在对照管符合要求的情况下，以肉眼未见生长的最低药物质量浓度为野鸦椿籽对细菌的MIC。再从未见细菌生长的试管中取0.02 mL 于相应培养基的琼脂平板上作次代培养，培养过夜，观察有无细菌生长。试验结果列于表1、表2。

由表1 可知，醇提取液抑菌效果较水提取液抑菌效果明显，与同一批次乙醇提取液萃取得到的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取液以及萃取后水层液，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌五种致病菌进行抑菌试验的试验结果列于表2。

表1 水提物与醇提物MIC (mg/mL)*

表2 不同极性萃取液MIC (mg/mL)

结果显示，野鸦椿籽提取物对各实验菌株均有不同程度的抑制作用，对甲型溶血性链球菌的抑制作用最强，二氯甲烷部分、正丁醇部分对各实验菌株的抑制作用最强，与乙醇提取液相比，二氯甲烷部分对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌抑制效果较好，正丁醇部分对乙型溶血性链球菌也较好，萃取后水层部分MIC 值均为10.00 mg/mL。

3 小结与讨论

目前，溶血性链球菌为产褥热最常见的致病菌，同时又表现为多重耐药性，给临床治疗带来了极大的困难。随着抗生素的滥用，给人们带来的危害越来越明显了，细菌对抗生素产生耐药性和抗药性，以致普通的抗生素对一些炎症起不到应有的疗效。近年来，链球菌感染致产褥热成为了主流的研究方向，Green［12］对上世纪80 年代欧洲导致产褥热死亡的致病菌进行了研究，发现致病菌为革兰阳性甲型链球菌。本实验结果显示野鸦椿籽中的有效成分对由甲型溶血性链球菌为主引起的炎症能起到很好的疗效。野鸭椿过去作为观赏性植物研究较多，但是关于药用成分及作用机理研究未引起人们的重视［13-14］。2004 年来，有关野鸦椿的研究文献逐年增多，多集中于其抗炎、抗纤维化、抗细胞增殖等方面的报道。临床上其用于杀虫和杀菌，为研究野鸦椿的药理指明了方向。目前，野鸦椿的杀虫杀菌、抗炎、抗肝纤维及抗癌成分的筛选及研究正处于发展中，发展前景广阔［15］。2012 年8 月1 日，国家出台的《抗菌药物临床应用管理办法》正式实施，该办法的实施使抗生素的临床应用受到限制，同时也为治疗感染的中成药新药研发提供了更大的发展机会。

在前期实验中发现野鸦椿籽总提取物具有较强的广谱抗菌作用，因此拟定对其抗菌活性部位进一步追踪。实验结果显示，野鸦椿籽不同溶剂提取物对5 种供试细菌的抑制作用均较为明显，为野鸦椿籽抑菌活性部位，所选细菌也具有一定的代表性。乙醇提取液对5 种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌的抑制活性均较高;二氯甲烷萃取液、正丁醇萃取液对5 种菌的MIC 也较高，对金黄色葡萄球菌效果最好的是二氯甲烷萃取液，大肠杆菌和甲型溶血性链球菌尤以乙醇提取液抑菌效果最好，正丁醇萃取液对乙型溶血性链球菌和肺炎链球菌抑菌效果最好。抑菌活性部位和活性成分的确定为进一步阐明野鸦椿籽有效物质基础提供了科学依据。

实验结果显示，野鸦椿籽提取物对5 种菌均有很强的抗菌活性，尤其是二氯甲烷、正丁醇部位。目前，正针对这两部分进行进一步研究其化学成分和活性，从而发现新的活性单体，筛选出抗菌活性更强的天然抑菌剂。

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