山楂叶总黄酮对2 型糖尿病大鼠肾脏IGF-1 和IGFBP-3 表达的影响

赵晓莲， 齐淑芳* ， 张 波， 杨馨妍， 张丹凤

(1. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯154007;2. 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154000)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)最常见、最严重的慢性微血管并发症之一，其进展速度约为其他类型肾病的14 倍，若不给予适当治疗，常在5 ～10 年内发展至终末期肾功能衰竭而死亡。因此，探讨糖尿病肾病的发病机制进而寻求有效的治疗手段一直是糖尿病研究领域的重要课题。山楂叶总黄酮(Hawthorn Leaves Flavonoids)具有广泛的药理作用，如强心、降血压、增加冠脉流量、降糖、调血脂、抗脂质过氧化、抑制或清除自由基、抗肿瘤、抗疲劳等［1］。近年来，山楂叶总黄酮在降血糖、调血脂、抗脑缺血等研究方面取得了重大进展，但有关其对糖尿病肾病的影响及机制的研究较少，尤其对糖尿病肾脏IGF-1 及IGFBP-3 影响的研究国内外尚未见报道。本研究通过复制2 型糖尿病肾病大鼠模型，给予山楂叶总黄酮干预治疗后，观察大鼠肾脏IGF-1、IGFBP-3 的表达情况，从不同的角度探讨山楂叶总黄酮对2 型糖尿病肾病的治疗作用及可能机制，为糖尿病肾病的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康Wistar 大鼠46 只，清洁级，3 ～4 月龄，体质量(220 ±20)克，雌雄各半，由黑龙江省佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 主要药物、试剂和仪器 山楂叶总黄酮:临沂爱康药业有限公司(批号423706，纯度90% );中效胰岛素注射剂(赛诺菲-安万特公司批号11041410);链脲佐菌素(美国Sigma 公司);RT-PCR 试剂盒及相关辅助试剂(大连宝生物工程有限公司);引物合成(上海生工生物工程有限公司)。PCR 仪、凝胶成像分析系统、血糖仪。

1.3 模型制备及分组 46 只健康大鼠适应性喂养1 周后，随机分为两组:正常对照组10 只和糖尿病模型组36 只。将36 只2 型糖尿病组大鼠给予高脂高糖饮食喂养4 周后，禁食16 h (自由饮水)，按50 mg/kg 一次性腹腔注射STZ注射剂，继续高脂高糖饮食4 周。正常对照组大鼠，给予基础饲料饮食，4 周后注射等体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。各组大鼠于实验9 周后尾静脉采血测空腹血糖(FBG)、留尿测24 h 尿蛋白。2 型糖尿病肾病组以空腹血糖≥16.8 mmol/L 且出现蛋白尿者为2 型糖尿病肾病大鼠造模成功［2］。将筛选后造模成功的30 只2 型糖尿病肾病大鼠随机分为3 组:STZ 糖尿病肾病模型对照组、山楂叶总黄酮组、胰岛素治疗对照组，每组10 只，继续给予高脂高糖饲养的同时，山楂叶总黄酮组给予山楂叶总黄酮200 mg/(kg·d)(依据前期预实验结果设定)，灌胃;正常对照组及STZ-糖尿病肾病组给予等量蒸馏水灌胃;胰岛素治疗对照组每天6 pm 给予中效胰岛素1 ～2 U 皮下注射。药物干预12 周后，所有大鼠称定质量、测24 h 尿蛋白、内眦静脉取血、取材后处死。

1.4 指标测定

1.4.1 全自动生化仪检测血脂、肌酐 (BCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白(Upr)等生化指标。采用血糖仪测定血糖。

1.4.2 肾组织形态学观察 各组大鼠肾组织甲醛固定、脱水、浸蜡、包埋、切片(片厚4 μm)后，HE 染色及PAS染色，光镜下观察。对PAS 染色切片进行分析。每张切片随机取20 个完整的肾小球，计算肾小球细胞外基质(ECM)的相对面积。

1.4.3 RT-PCR 法检测肾组织IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表达 按Trizol 法试剂盒操作提取肾皮质总RNA;按RT-PCR试剂盒说明操作合成cDNA;PCR 反应扩增DNA (各引物序列及扩增条件见表1)。用凝胶图像成像分析系统拍摄并分析结果，以目的基因与β-actin 吸光度的比值表示其相对含有量。

1.5 统计学分析 所有实验数据采用SPSS 18.0 统计软件处理，数据以±s 表示;组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验，以P ＜0.05 为有统计学意义;指标之间的相关性分析采用t 检验。

2 结果

2.1 山楂叶总黄酮对血糖、血脂的影响 模型组大鼠血糖明显升高，血脂代谢紊乱，经山楂叶总黄酮治疗后血糖下降，血脂代谢紊乱明显改善，与治疗对照组比较无统计学意义(见表2)。

表1 引物序列及扩增条件

表2 山楂叶总黄酮对血糖、血脂的影响(±s，n=8)(mmol/L)

表2 山楂叶总黄酮对血糖、血脂的影响(±s，n=8)(mmol/L)

注:与正常组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，##P ＜0.01

组别 血糖 甘油三酯 总胆固醇 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常组 9.501 ±2.221 0.689 ±0.101 1.498 ±0.190 0.231 ±0.034 2.578 ±0.251模型组 22.346 ±4.428＊＊ 2.560 ±0.205＊＊ 4.682 ±0.300＊＊ 0.755 ±0.043＊＊ 1.618 ±0.178＊＊阳性组 8.933 ±2.996## 0.785 ±0.126## 1.635 ±0.175## 0.259 ±0.022## 2.448 ±0.192##山楂叶总黄酮组 11.061 ±3.603## 0.876 ±0.133## 1.785 ±0.192## 0.268 ±0.030## 2.263 ±0.205*##

2.2 山楂叶总黄酮对肾功能及肾组织结构的影响 模型组大鼠尿蛋白明显升高，肾脏功能明显降低。而山楂叶总黄酮能显著降低尿蛋白，改善肾功能，其效果与胰岛素治疗组无明显差异。

HE 及PAS 染色后，镜下可见正常组大鼠肾小球、肾小管形态结构完整，肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常，肾小管形状规则，未见肥大。模型组大鼠肾小球系膜细胞增生，部分肾小球硬化，肾小管上皮细胞肿胀、坏死，肾小球系膜区增宽，系膜基质明显增多，基底膜增厚，正常肾小管减少，扩张肾小管增加，病理改变明显。各治疗组较模型组均有不同程度改善，且山楂叶总黄酮组与治疗对照组比较肾小球细胞外基质的相对面积无明显差异(见表3)。

表3 山楂叶总黄酮对肾功能、ECM 的影响(±s，n=8)

表3 山楂叶总黄酮对肾功能、ECM 的影响(±s，n=8)

注:与正常组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，##P ＜0.01

组别 24 h 尿蛋白/(mg·24 h -1) 血肌酐/(μmol·L -1) 尿素氮/(mmol·L -1)ECM正常组 10.953 ±1.421 55.592 ±10.556 10.659 ±1.333 0.038 ±0.011模型组 34.802 ±2.815＊＊ 116.523 ±12.688＊＊ 21.224 ±1.695＊＊ 0.120 ±0.015＊＊阳性组 13.002 ±1.365* ## 62.355 ±7.862## 11.588 ±1.100## 0.062 ±0.006＊＊##山楂叶总黄酮组 14.045 ±1.550* ## 69.348 ±9.900* ## 11.532 ±1.008## 0.056 ±0.007＊＊##

2.3 山楂叶总黄酮对肾组织中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表达的影响 正常组大鼠肾组织中均可见IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表达，模型组的表达明显增加。经山楂叶总黄酮治疗后大鼠肾组织IGF-1、IGFBP-3 mRNA 的表达均明显减少且两者成正相关(P ＜0.01，r =0.994)。山楂叶总黄酮组与治疗对照组比较无统计学意义(见表4 及图1、2)。

3 讨论

GH/IGF-1 轴是由GH、IGF-1、IGF-1R 及IGFBPs 组成的复杂系统，该轴系统保持动态平衡对机体组织的分化、增殖及物质代谢具有极其重要的调节作用［3］。大量动物、临床实验表明［4-5］，糖尿病患者体内存在GH/IGF-1 轴系统的紊乱，这种紊乱不仅加剧糖尿病患者的高血糖，而且可促进糖尿病慢性并发症如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变的发生、发展。近年来的研究证实，肾脏局部GH/IGF-I 的紊乱参与了糖尿病肾病的发生、发展。其中，IGF-1 及IGFBP-3 在2 型糖尿病肾病早期发病中的作用已引起临床医师的重视。

表4 山楂叶总黄酮对肾组织中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表达的影响(±s，n=8)

表4 山楂叶总黄酮对肾组织中IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表达的影响(±s，n=8)

注:与正常组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，##P ＜0.01

组别 (IGF-1/β-actin) (IGFBP-3/β-actin)0.387 ±0.016 0.296 ±0.020模型组 0.640 ±0.013＊＊ 0.403 ±0.009＊＊阳性组 0.406 ±0.015* ## 0.334 ±0.016＊＊##山楂叶总黄酮组 0.412 ±0.021* ## 0.345 ±0.021＊＊##正常组

图1 IGF-1 mRNA 的表达

图2 IGFBP-3 mRNA 的表达

IGF-1 普遍存在于哺乳动物的组织中，大部分IGF-1 与IGFBPs 结合，以非游离状态存在，而只有少部分游离的IGF-1 不与任何IGFBP 结合，可以与其受体IGF-1R 结合，发挥其促进细胞生长、抑制细胞凋亡的生物活性。正常生理条件下，IGF-1 系统不能导致肾组织损害，只有在机体损伤，如在糖尿病条件下，才会导致细胞增殖［6］。糖尿病肾病早期出现的肾脏肥大、肾小球高滤过、肾小球系膜细胞增生及ECM 聚积与IGF-1 密切相关，其过度表达对糖尿病肾病的发生具有始动作用。

糖尿病肾病时肾组织中IGF-1 表达增高的原因可能为:①高血糖导致缺氧，引起机体氧化还原系统紊乱，进而引发蛋白激酶C 的失活，最终导致IGF-1 的生成增多［7］;②高糖可使肾小球系膜细胞IGF-1 表达增加;③高糖可使肾脏成纤维细胞IGF-1 表达上调［8］;④有学者［9］报道，在糖尿病肾病发病过程中，由于外周循环血中IGF-1 的增加导致肾脏IGF-1 积聚，但肾脏本身IGF-1 mRNA 的表达并不增加，其原因可能与IGFBPs 表达有关;⑤有学者［10］研究认为，糖尿病肾病的肾小球系膜损伤引起肾脏局部IGF-1 的旁分泌合成代偿性增多，同时其降解减少，最终导致IGF-1 水平增高;⑥糖尿病肾病时，伴随肾脏IGF-1 表达的增加，IGFBP-3 表达也增加，提示IGFBP-3 可能通过调节肾脏局部IGF-1 的自分泌和(或)旁分泌，导致肾脏IGF-1 合成增加。

肾脏IGF-1 的过度表达导致糖尿病肾病的发生、发展，其机制为［11］:①IGF-1 能使系膜细胞增殖引起肾脏增大;②高糖条件下，IGF-1 可促进系膜细胞分泌大量NO，导致肾小球入球小动脉扩张，从而引起GFR 增加;③IGF-1 可引起脂质沉积，形成泡沫细胞，损害系膜细胞功能;④IGF-1 通过诱导系膜细胞产生大量的纤维连接蛋白、胶原蛋白Ⅳ和层黏蛋白，促进细胞的进一步增生和基质的进一步增多，从而对系膜细胞产生持久作用，最终导致肾小球硬化;⑤IGF-1 通过诱导肾脏激肽释放酶-激肽系统和肾素释放增加，从而改变肾小球的血流动力学;⑥IGF-1 可持续降低金属蛋白酶2 的活性，从而使系膜胶原蛋白降解减少，ECM 堆积，导致肾小球硬化。

机体各种组织几乎均可合成、分泌IGFBPs，这些结合蛋白质作为生物应答的缓冲剂，具有重要的生物学意义。迄今已发现6 种IGFBPs (IGFBP1-6)，其中IGFBP-3 是人体中数量最多，作用最强的结合蛋白，其通过与IGF-1 结合而阻止IGF-1 降解，延长其半衰期，从而调节IGF-1 的生物学有效性和生物学活性。

本实验采用RT-PCR 和免疫组化的方法研究了STZ-糖尿病肾病大鼠肾组织IGF-1 和IGFBP-3 的mRNA 水平的表达。结果显示，模型组大鼠IGF-1 和IGFBP-3 在肾小球、近曲小管、远曲小管和集合管中的表达均较正常组明显增加。提示糖尿病肾病早期肾脏IGF-1 和IGFBP-3 的异常表达参与了糖尿病肾病的发生、发展。结果也显示IGF-1、IGFBP-3 呈显著正相关，说明IGF-1 水平与IGFBP-3 有关，提示IGFBP-3 可能调节IGF-1 在肾组织中的水平。同时也说明在导致糖尿病肾病的过程中，IGF-1 与IGFBP-3 可能有协同作用。

山楂叶总黄酮是山楂叶中黄酮类化合物的总称，也是山楂叶生理活性的主要成分，具有降糖、调脂、抗氧化、改善心脏功能等多种功效，尤其在心脑血管疾病方面的防治作用以及调血脂、抗衰老等作用，使之愈来愈受到广大医药工作者的关注。本实验结果显示，山楂叶总黄酮能明显降血糖、调血脂，下调IGF-1 和IGFBP-3 的表达，改善肾脏功能。高血糖、IGFBP-3 的表达增多、糖尿病肾病时的肾小球系膜损伤等因素都可以明显增加肾脏IGF-1 的水平，进而导致糖尿病肾病的发生。山楂叶总黄酮可通过下调IGF-1 及IGFBP-3 的表达，减缓糖尿病肾病的发生、发展。其机制可能为:①通过降糖作用改善氧化还原系统功能，减少机体IGF-1 的过度合成;②通过降糖作用抑制肾脏成纤维细胞和肾小球系膜细胞IGF-1 的高表达;③通过降糖作用抑制系膜细胞分泌大量的NO，改善肾小球血流动力学变化，减轻肾小球的髙滤过;④通过减轻肾小球系膜损伤，从而抑制肾脏局部代偿性合成IGF-1 并恢复其降解功能，使IGF-1 水平下降;⑤通过降低IGFBP-3 的表达，抑制由IGFBP-3 刺激肾脏局部合成IGF-1 的增多。但山楂叶总黄酮能下调IGFBP-3 表达的机制还有待进一步研究。

总之，尽管糖尿病肾病的发病机制尚未完全明了，但IGF-1 和IGFBP-3 在STZ-糖尿病肾病肾组织中的蓄积无疑会导致糖尿病肾病的发生。因此，有效调控IGF-1 及IGFBP-3 的表达，为防治糖尿病肾病提供了新的思路。山楂叶总黄酮可通过降糖、调脂、下调IGFBP-3 水平等作用，降低IGF-1 的表达，从而改善STZ-糖尿病肾病的肾功能减退，但其作用机制有待进一步完善。

［1］ 齐淑芳，赵晓莲，王跃新，等. 山楂叶总黄酮对糖尿病大鼠肾脏TGF-β1/Smad4 信号转导通路的影响［J］. 中成药，2012，34(9):1795-1797.

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