槐杞黄颗粒对过敏性紫癜肾炎大鼠蛋白尿及肾组织TGF-β1 表达的影响

武 青， 袁 斌 ， 徐建亚， 周立华， 孔 飞， 张奕星

(1. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京210029;2. 南京中医药大学附属医院儿科，江苏 南京210029)

过敏性紫癜肾炎 (Henoch-Schonlein purpura nephritis)是儿科常见的继发性肾病，一般认为在过敏性紫癜患儿中有20% ～55%［1］可发生肾脏损伤。也有报道称［2］，过敏性紫癜患儿患病6 个月后肾活检示不同程度的肾损害几乎占100%。本病大多预后良好，但部分病程迁延、少数还可发展至慢性肾功能不全［3］。目前西医治疗尚缺乏特异性方案，中医药在提高免疫力，改善蛋白尿等方面有独特优势。对免疫功能具有双向调节作用［4］的中药制剂槐杞黄颗粒是由槐耳菌质配伍枸杞子、黄精制成的颗粒剂，具有益气养阴之功效，临床实验已证实其对改善微循环及减少尿蛋白有良好效果。本实验通过建立过敏性紫癜肾炎大鼠模型，观察槐杞黄颗粒对过敏性紫癜肾炎的大鼠蛋白尿及肾组织TGF-β1 表达的影响，探讨槐杞黄颗粒治疗过敏性紫癜肾炎的作用机制，以期为过敏性紫癜肾炎的临床治疗提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组 选取健康清洁级6 周龄雄性SD 大鼠18 只(购于南京青龙山动物繁殖场，合格证号:SCXKZ2009-0001)，体质量约120 ～150 g，适应性喂养1 周，所有大鼠造模前两次尿蛋白定性试验均呈阴性(试纸条法)。将大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组和槐杞黄组，每组6 只。实验结束时(第16 周末)处死所有大鼠。

1.2 实验药物 牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)购自美国Sigma 公司;四氯化碳(CCl4)、蓖麻油由南京顶德生物科技有限公司提供;干姜及槐杞黄颗粒(启东盖天力药业有限公司)由江苏省中医院提供。

1.3 主要实验器材 ELISA 试剂盒购自美国R＆D公司;BCA 试剂盒购自Thermo Pierce 公司;Trizol及逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒均购自TaKaRa 公司;PCR 内参及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有实验耗材及仪器均由南京中医药大学第一临床医学院实验室提供。

2 实验方法

2.1 过敏性紫癜肾炎大鼠模型的建立 参考张晓强等［5］关于过敏性紫癜动物模型的研制思路，综合模拟IgA 肾病与血热证动物模型，复合成为过敏性紫癜肾炎大鼠模型。模型组及槐杞黄组运用BSA灌胃，LPS 尾静脉注射，结合CCl4皮下注射造就IgA 肾病模型。用蒸馏水配制10%免疫原BSA，隔天灌胃4 mL/kg，持续8 周;皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL，每周1 次，持续9 周;用等渗盐水配制0.025% LPS，分别于第6、8、10、12 周尾静脉注射0.2 mL;模型组同时造就血热模型，复合为过敏性紫癜肾炎大鼠模型，于第9 周开始隔天灌服25%干姜水10 mL/kg，建模期间室温维持在30 ℃。空白组给予等量蒸馏水灌胃，等量等渗盐水皮下注射及尾静脉注射，环境温度为室温。至12 周末造模结束。

2.2 给药方法及剂量 根据施新猷［6］动物药物剂量换算公式“大鼠剂量(mg/kg) = 成年人剂量(mg/kg) ×折算系数(6.25)”，槐杞黄组自第13周起灌服槐杞黄颗粒12.6 g/kg，配制为25%的溶液。每天早晚各1 次，连续4 周;空白组及模型组在第13 周起给予相应等量蒸馏水灌胃。所有大鼠均予标准饮食。

2.3 血尿及蛋白尿检测 实验结束(第16 周末)用代谢笼分别收集所有实验大鼠24 h 尿液，并记录尿量。观察肉眼血尿程度，并采用定量尿沉渣计数法检测尿红细胞个数，BCA 法检测大鼠24 h 尿蛋白定量。

2.4 肾脏病理检查 尿液收集后，用10%水合氯醛麻醉并处死所有实验大鼠，取出肾脏，并分离肾皮质，用4%甲醛固定肾皮质，常规石蜡包埋，切片厚4 ～5 μm，PAS 染色，光镜下观察肾组织病理改变。

2.5 ELISA 法检测肾组织中TGF-β1 的水平 取各组肾组织，制成10%匀浆，采用酶联免疫吸附法(ELISA 法)检测肾组织TGF-β1 水平，操作顺序严格按照试剂盒说明书进行。

2.6 实时荧光定量PCR 检测肾皮质TGF-β1 mRNA 的表达 以GAPDH 为内参(内参及引物序列见表1)。Trizol 抽提肾组织皮质总RNA，紫外分光光度仪测RNA 浓度、A260/280 及A260/230，严格按逆转录试剂盒说明配制逆转录试剂，将RNA逆转录为cDNA，取2 μL cDNA 加入总体积为20 μL的PCR 反应体系中(反应液按试剂盒说明配制)，7500 全自动荧光定量PCR 仪按95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;57 ℃，34 s;95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;95 ℃，5 s 反应条件循环40 次进行实时定量PCR 反应，退火温度为57 ℃。取各样本CT 值，按(实验组目的基因-实验组内参基因) - (空白组目的基因 - 空白组内参基因)公式计算2 -ΔΔCT 值，以空白组为对照(空白组2 -ΔΔCT 值为1)，实验组2 -ΔΔCT 值≥2 认为目的基因表达增加，实验组2 - ΔΔCT 值＜0.5 认为表达下降，重复至少3 次以上用以统计。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

3 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学处理，正态分布数据用均数±标准差(±s)表示，偏态分布用中位数(四分位间距)，即M (QR)表示。资料正态分布且方差齐时，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差异法(LSD);资料偏态分布时，采用秩和检验(Kruskal-Wallis)。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 血尿及蛋白尿 3 组大鼠尿红细胞计数差异有统计学意义(P=0.009)，其中模型组和空白组相比，红细胞计数明显增高(P =0.013)，槐杞黄组较模型组红细胞数量有减少趋势，但无统计学意义(P=0.334);3 组大鼠24 h 尿蛋白定量不全相等(P = 0.018)，其中模型组显著高于空白组(P=0.000)，槐杞黄组蛋白尿较模型组明显缓解(P =0.016)。见表2 ［红细胞计数呈偏态分布，数据用中位数(四分位间距)，即M (QR)表示;尿蛋白定量呈正态分布，数据用均数± 标准差(±s)表示］。

表2 大鼠尿红细胞计数及24 h 尿蛋白定量Tab.2 Count of urinary red cells and 24-hour urinary protein quantity

4.2 光镜下肾组织病理改变 光镜下，空白组肾小球系膜、基底膜无增生，肾小球未见硬化;模型组可见肾小球系膜明显增生，肾小管肿胀，伴见节段性肾小球硬化，肾小球血管襻坍陷，血管周围有炎性细胞浸润;槐杞黄组肾小球系膜增厚，但较模型组好转，有少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理(PAS 染色×200)Fig.1 Renal histopathology of each group (PAS staining×200)

4.3 ELISA 法检测肾组织中TGF-β1 的水平 模型组大鼠肾组织皮质TGF-β1 的水平较空白组明显升高，槐杞黄组TGF-β1 的水平较模型组有所降低，差异均有统计学意义(前者P =0.005，后者P =0.042)，见表3。标准曲线图见图2。

图2 ELISA 标准曲线图Fig.2 Canonical plotting of ELISA

表3 肾组织中TGF-β1 测定Tab.3 TGF-β1 content in nephridial tissue

4.4 肾组织TGF-β1 mRNA 的表达( 见表4) 模型组大鼠肾组织皮质TGF-β1 mRNA 的表达较空白组明显提高，而槐杞黄组TGF-β1 mRNA 的表达较模型组显著降低，差异均有统计学意义(前者P =0.026，后者P=0.040)。

表4 肾组织TGF-β1 mRNA 表达量2 - ΔΔ CTTab.4 2 - ΔΔ CT value of mRNA expression quantity about TGF-β1

5 讨论

过敏性紫癜是一种由免疫复合物介导的系统性小血管炎，过敏性紫癜肾炎也属免疫复合物性肾病，临床以血尿和蛋白尿为主，多发生于皮肤紫癜后一个月内，可以同时并见皮肤紫癜、腹痛、关节肿痛、便血等，有的仅是无症状性的尿异常。目前对于过敏性紫癜的发病机制，认为与体内免疫功能紊乱相关［7］，主要通过体液免疫，但也涉及细胞免疫，一些细胞因子和炎症介质，凝血机制均参与本病发病。

过敏性紫癜肾炎主要为系膜增生性肾小球肾炎，常伴节段性肾小球毛细血管袢坏死、新月体形成等血管炎表现。系膜细胞的增殖与细胞外基质的过度沉积是各种系膜增殖性肾病的病理基础。肾小球系膜细胞能分泌TGF-β1，TGF-β1 通过与系膜细胞上相应的受体结合来调节其增殖速度和基质蛋白的合成。不难看出，TGF-β1 是各种肾脏病(如肾间质纤维化和肾小球硬化)发生、发展的必要因子，其最大特点是能够使多种细胞停留在G1 期，从而抑制细胞生长［8］。在体外，外源TGF-β1 可诱导正常的肾小球、肾小球膜和非肾细胞产生细胞外间质，且抑制蛋白酶的活性，同时其中和抗体可阻止大白鼠肾组织中细胞外基质的积累［9］，因此，TGF-β1 过度产生在许多肾脏病中引起了不可逆的肾间质纤维化［10］，抑制TGF-β1 表达是治疗甚至预防其发生、发展的关键［11］。

目前西医治疗以激素和免疫抑制剂为主，但这种免疫性炎症因为受免疫因子的影响，对炎症的过度抑制或抑制不足都可能促进炎症的发展。使用外源性免疫抑制剂的剂量与组织的炎症程度很难做到恰到好处，这为彻底控制炎症带来极大困难，效果也不十分理想。因此探索中药对过敏性紫癜肾炎的治疗具有很大的临床价值。

本实验采用综合模拟瘀热证与IgA 肾病动物模型，复合成为过敏性紫癜肾炎大鼠模型的造模方式，结果显示模型组大鼠出现较为严重的血尿、蛋白尿，而且肾病理显示肾小球系膜细胞增生及节段性肾小管硬化，间接免疫荧光及RT-PCR 均表现模型组肾组织皮质TGF-β1 水平及TGF-β1 mRNA 表达升高，这都说明了模型组大鼠存在肾损害，造模较成功。

中医认为，本病的病机除了瘀热，还与气阴亏损体质密切相关。小儿肾常虚，肾阳未充，封藏失司，阴精外泄，或肾病日久，温阳太过伤损于阴，肾水匮乏，水不涵木，肝肾阴虚火旺，灼伤血络而见血尿，虚火迫血妄行，外溢肌肤而发紫癜，久病气虚无以固肾，精微下泄则产生蛋白尿［12］。而且肾脏疾病通过激素治疗后往往加重气阴亏损表现。精不化气而化水，水停则气阻，气滞则血瘀，气阴亏损，无力推动血液运行，加重血行瘀阻而致血瘀的症状，而血不利则病水，形成恶性循环。气阴亏损若能得到改善，气行推动血行，血瘀症状也将有所好转，这和槐杞黄颗粒临床研究中提示其能改善微循环的结论是一致的。所以益气养阴法为治疗过敏性紫癜肾炎的方法之一。槐杞黄颗粒以功擅益气强壮的槐耳为君药，配合臣药枸杞子滋养肾阴、黄精补气而兼润养，药均和平，平补气阴，平中寓奇，共奏益气养阴之功，有效改善微循环及过敏性紫癜肾炎大鼠蛋白尿水平。

结合本实验，槐杞黄组TGF-β1 及TGF-β1 mRNA 表达显著低于模型组，说明槐杞黄颗粒的益气养阴之功能有效下调TGF-β1 mRNA 的表达，TGF-β1 的水平下降也体现在槐杞黄组肾小球系膜增厚、节段性肾小球硬化及血管周围有炎性细胞浸润等病理表现都较模型组好转，而病理表现从另一方面也充分证明了槐杞黄颗粒可以促进组织修复，有效减少微循环梗塞，延缓过敏性紫癜肾炎的进展，减少蛋白尿。作为中药复方制剂，槐杞黄颗粒成分相对复杂，目前应用的方法不能对全部(或大部分)成分进行研究和观察，且作用机制比较复杂［13］，需进一步研究，当然，有效成分组的研究还存在许多尚解决的问题，如选择生物活性检测的指标，分析活性筛选的结果，多种活性成分的综合分析以及作用机理研究等等，都有待在实践中进行探讨［14-15］。另外，因过敏性紫癜肾炎动物模型还不成熟且该实验样本较少，益气养阴法是否通过其他通路途径改善过敏性紫癜肾炎肾损害及其纠正肾损害的具体机制还需进一步实验研究。而且试验中槐杞黄组血尿水平虽较模型组降低，但不具统计学意义，因此槐杞黄颗粒能否改善血尿水平亦有待进一步实验验证。

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