Tg-SwDI小鼠的筑巢行为研究

闵喆，王淑楠，吴军，黄晓江，方瑜，邱占东，张苏明

·论著·

Tg-SwDI小鼠的筑巢行为研究

闵喆1，王淑楠1，吴军2，黄晓江1，方瑜1，邱占东1，张苏明1

目的：研究不同年龄组Tg-SwDI小鼠与同龄野生型（WT）小鼠筑巢行为的差异。方法：将小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年龄（2～4月龄、10～12月龄、18～20月龄）分为6组，利用固有筑巢材料在群养小鼠家笼中进行集体筑巢行为实验，之后利用纸巾进行个体筑巢实验。结果：基因（F1,31=37.03，＜0.0001）和年龄因素（F2,31=3.88，＜0.05）对群体筑巢评分均有影响。Tg-SwDI小鼠与WT小鼠相比，各年龄组均有群体筑巢功能的下降。在个体筑巢实验中，2～4月龄和10～12月龄Tg-SwDI小鼠的个体筑巢功能下降不明显，18～20月龄组有显著变化。方差分析提示显著的基因（F1,135=23.64，＜0.0001）和年龄（F2,135=15.46，＜0.0001）影响。结论：Tg-SwDI小鼠可较早出现集体筑巢行为受损，可能反映其早期社交行为改变，与执行功能相关的个体筑巢行为较晚才出现明显下降。

阿尔茨海默病；Tg-SwDI小鼠；筑巢行为

随着人口老龄化的加速，阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）已成为严重威胁人类健康和生活质量的医学难题。围绕认知功能下降这一核心症状，执行功能受损和日常生活能力降低及行为和精神症状（behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）等均给患者及看护者带来了严重的负担[1]。目前对AD患者的治疗越来越提倡多靶点全方面管理理念，即除了对认知功能下降进行治疗，还应对社交行为、情绪及精神行为异常等症状进行治疗；治疗手段除药物治疗外，还应重视护理、认知康复锻炼等非药物干预方法的运用[2]。目前对AD复杂临床症状的机制和治疗方法的研究在很大程度上有赖于动物模型来完成，AD转基因小鼠模型的出现可帮助人们更好地了解AD的病理生理机制以及寻找有效的治疗手段[3]。对AD转基因小鼠行为学的研究，也不能仅局限于对学习能力和记忆力相关的认知行为研究，还应更多关注日常生活行为、社交行为和非认知行为等方面的研究。

筑巢，是小鼠常见的一种日常行为，它不仅是一种具有庇护幼崽作用的母性行为，而且是维持体温的本能行为，群居小鼠的集体筑巢更具有社会交流性质[4]。小鼠筑巢行为的生理学基础复杂，可能受到许多脑区和神经递质活动的控制。近来陆续有文献报道在几种不同的AD转基因小鼠发现筑巢行为异常，但研究结果存在一些矛盾，其病理生理机制及其在AD研究中的应用价值还有待进一步阐明。筑巢行为实验研究方法简便易行，且过程几乎无创，可反映小鼠的社会行为和日常活动能力，为研究AD的动物行为学研究提供了一种新的手段。

以往的多数小鼠转基因模型都聚焦在脑实质老年斑的模拟上，而用于研究脑淀粉样血管病 （cerebral amyloid angiopathy，CAA）相关病理变化的模型相对较少。Tg-SwDI转基因小鼠表达瑞典型（Swe K670N/M671L）、荷兰型（Dutch E693Q）和爱荷华州型（Iowa D694N）3种不同的人APP突变基因，同时具有脑实质Aβ沉积与显著的脑血管Aβ沉积，并伴有进行性加重的胶质细胞和炎性细胞增生，是一种较新的研究AD和CAA的良好模型[5]。Tg-SwDI转基因小鼠自面世以来，科学家们对其病理学特点做了详细的研究，发现相对于其他AD转基因模型，其很早（3月龄）就在海马下托出现CAA样病理变化伴胶质细胞增生活化，随着年龄的增长，在海马齿状回、丘脑、皮质、嗅球等区域均逐步出现Aβ沉积且进行性加重，与之相伴随的是在巴恩斯迷宫实验中体现出早发的空间学习与记忆功能下降。此后人们利用这种动物模型通过各种方法继续研究AD及CAA的相关病理机制，并用它来探讨和评价一些AD潜在治疗方法的有效性和作用机理。但对于其行为学表现特征却研究得并不充分。关于这种小鼠的筑巢功能的研究还未见相关报道，因此，本研究选择3个不同年龄组Tg-SwDI小鼠和相应的野生型（wild type，WT）小鼠进行筑巢行为的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

纯合子 Tg-SwDI转基因小鼠[C57BL/6-Tg (Thy1-APPSwDutIowa)BW-evn/J]由购自美国Jackson实验室的2对种鼠在华中科技大学同济医学院实验动物中心繁殖。野生型C57BL/6小鼠由购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司的4对种鼠在相同环境传代繁殖。至本实验开始时，Tg-SwDI小鼠与WT C57BL/6小鼠均在华中科技大学同济医学院实验动物中心繁殖传代超过5代，饲养环境保持12∶12 h的昼夜节律，温度保持（22±2）℃，空气湿度约50%～60%，动物饲养于含刨花垫料的（28× 12×16）cm3的标准树脂鼠笼中，足量自由摄取水和饲料。动物饲养及所有实验操作均严格遵守华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会的相关规定进行。

1.2 方法

1.2.1 分组 将小鼠按基因（Tg-SwDI和WT）和年龄（2～4月龄、10～12月龄、18～20月龄）分为6组，每组21～28只，见表1。

表1 动物分组

1.2.2 群体筑巢实验 利用固有筑巢材料在群养小鼠家笼中进行，每笼有相同基因型、相同年龄与性别小鼠3～5只，每组5～7笼。实验第1天更换垫料，每笼放入刨花垫料均匀铺开，厚度1 cm，让小鼠适应24 h后，在第2天夜节律前2 h再均匀加入体积为（750±50）mL的刨花垫料，第3天（18 h后）观察筑巢情况。按照4分法对筑巢质量进行评分：1分，没有可见的巢；2分，较浅的巢，巢呈碟状，可有缺口；3分，中等的巢，巢呈碗状，无缺口，但高度小于小鼠的卧高；4分，很好的巢，巢呈杯状，巢的外壁明显高于巢外垫料，高度达到或超过小鼠的卧高。并观察每笼中小鼠粪便的分布情况。所有小鼠由同一观察者评分，评分时不知道小鼠的基因和年龄信息（盲法评分）。

1.2.3 个体筑巢实验 小鼠完成群体筑巢实验3 d后进行个体筑巢实验。将上述群养的各组小鼠分成单笼（每笼1只），让其适应单笼环境48 h后，在每笼中换入厚度1 cm的刨花垫料，夜节律前2 h均匀平铺放入剪裁大小一致的正方形无味薄纸巾片16张（边长4.5 cm），18 h后按照根据文献[5]改良的4分法对筑巢质量进行评分：1分，纸片杂乱的散布在笼子各处，没有被撕咬；2分，纸片被聚到笼子的一侧，但较松散，没有成型的巢，没有明显的撕咬或折叠；3分，纸片聚拢折叠呈成型但较平的巢，没有明显的撕咬；4分，纸片聚拢折叠成较深的巢，并被撕咬成小块，见图1。所有小鼠均采用盲法评分。

图1 纸巾个体筑巢评分方法（4分法）

1.3 统计学处理

采用Prism软件进行统计分析与图表绘制，结果以（均数±标准误）表示，双因素方差分析年龄与基因因素对筑巢行为的影响，组间两两比较采用事后检定，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 群体筑巢实验结果

基因型（F1,31=37.03，＜0.0001）和年龄（F2,31=3.88，＜0.05）对群体筑巢评分均有影响，见图2A。Tg-SwDI小鼠与WT小鼠相比，各年龄组均有群体筑巢功能的下降。而基因型和年龄这两个因素之间的相互作用对 筑巢 评 分 无显 著 影 响（F2,31=0.07，＝0.93）。此外，WT小鼠的粪便多位于所筑巢的远端，巢内很少有粪便；而Tg-SwDI小鼠粪便则分布散乱，尤以18～20月龄为甚。

2.2 个体筑巢实验结果

与WT小鼠相比，在2～4月龄和10～12月龄，Tg-SwDI小鼠的个体筑巢功能下降均不明显，18～20月龄才有显著变化，见图2B。但双因素方差分析仍提示显著的基因（F1,135=23.64，＜ 0.0001） 和年 龄（F2,135=15.46，＜0.0001）差异，二者相互作用的影响则无统计学差异（F2,135=1.32，＝0.27），见图2。

图2 各组群体筑巢（A）及个体筑巢（B）评分比较

3 讨论

基于AD和CAA发病机制的β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）毒性学说，产生了许多不同的异常表达Aβ的转基因动物模型（主要是小鼠模型），这些模型一方面可部分模拟人类AD的病理表现，另一方面可部分模拟AD患者可能出现的行为异常，一个成功的AD小鼠模型二者缺一不可。这些动物模型及相应行为学实验方法的出现为人类探索AD等疾病的病因及其发病机制，寻找有效的诊疗手段提供了非常重要的研究途径。

筑巢是小鼠常见的日常行为，与母性行为、社交行为、体温保持等因素有关[4]。关于AD转基因小鼠筑巢行为的研究并不多，以个体筑巢实验为主，且不同研究结果存在不一致性。有研究发现APPswe/PS1A246E双转小鼠6月龄即出现筑巢功能受损[7]。在Tg-2576小鼠，有文献报道2～3月龄即可出现个体筑巢功能的下降且随年龄增加而加重[8]。但较早的报道却发现这种小鼠只有群体筑巢功能的下降而个体筑巢功能不受影响[4]。本研究在Tg-SwDI小鼠观察到的现象与之相似：这种小鼠早期即可出现群体筑巢功能下降，但个体筑巢功能直到18～20月龄才出现明显下降，提示两种筑巢行为可能受不同因素影响，而影响个体筑巢功能的因素可能更为复杂。

群体筑巢可能更多地受社交行为的影响。当群居时，小鼠抱团睡觉，可以使体温丧失降低到最小程度。这种抱团行为属于社交行为，对环境的变化很敏感[4]。此前有文献报道在AD转基因小鼠模型可出现攻击性增强[9]，笔者也观察到某些雄性Tg-SwDI小鼠与WT小鼠相比具有更强的攻击性，而这种同笼群养小鼠之间的攻击行为显然可能会影响群体筑巢中的协作。攻击性增强和社交行为异常在临床上均是AD患者的较常见症状[10]，群体筑巢实验似乎可以较好地模拟这类症状。但目前群体筑巢实验多用于自闭症等精神疾病模型的研究[11]，在AD模型中的研究报道屈指可数，其机制和意义还需更多研究来阐明。

个体筑巢行为可能主要反映小鼠日常活动的执行能力[12]。既然筑巢的一个主要动机是保持体温，由于个体筑巢实验环境下无法再“抱团取暖”，体温丢失更快，因此，这种情况下小鼠具有更强烈的筑巢动机，除非执行功能下降导致无法完成筑巢。小鼠筑巢行为的生物学基础较复杂，可能受到多个脑区和神经递质活动的控制。目前认为AD模型鼠的筑巢功能下降可能与Aβ对相关功能脑区的神经毒性有关，有些AD小鼠在出现老年斑之前便有个体筑巢功能的下降，提示可溶性Aβ的毒性可造成筑巢损害[8]；但本实验在Tg-SwDI小鼠所见以及其他一些研究的结果[4]却发现个体筑巢功能的下降出现较晚，即在出现大量老年斑后才出现筑巢损害。而此前在3xTgAD小鼠还观察到用棉花作为筑巢材料时，其与WT小鼠无差异[12]，而用纸巾筑巢时可观察到筑巢行为延迟，提示筑巢材料的偏好和难易程度也可能影响筑巢结果。目前，针对不同AD模型甚至相同模型的研究结论不尽相同，可能与实验方法、模型的基因背景和病理特点、动物饲养环境等诸多因素相关，其具体机制还有待进一步研究揭示。

目前针对AD模型小鼠的行为学实验多集中在空间学习和记忆相关的认知功能方面，而关注其日常活动和执行功能的实验很少，筑巢实验无疑是一个很好的选择。筑巢一方面有助于研究AD患者发生日常活动和执行功能下降的病理生理机制，另一方面为利用动物模型研究AD的药物及康复治疗手段提供了良好的行为学评价工具。目前已有研究发现一些治疗AD的候选药物，在减少AD模型鼠Aβ沉积的同时可以改善筑巢行为[13,14]。由于近年来认知康复锻炼等非药物干预方法在AD治疗中的应用越来越引起重视，因此，筑巢实验在利用动物模型评估丰富环境等康复训练相关疗法的研究中也将有较广泛的应用前景[15]。有研究发现剥夺小鼠的筑巢材料会增加其应激反应水平[8]，而相反在群养雄性小鼠笼中放入棉块（筑巢材料）可降低其攻击性[4]。那么给AD动物模型早期提供棉块、纸巾等筑巢材料是否可作为一种功能锻炼方法延缓其执行功能的下降？或者提供筑巢材料可否作为丰富环境的一部分加强其效果？如何有意识地训练AD患者铺床、叠被或其他日常行为从而对延缓其病情进展产生帮助？另一方面，AD相关动物模型产生筑巢行为损害的病理生理机制还有待进一步阐明；动物筑巢行为模拟AD患者日常行为能力的效度也有待进一步评估。因此，围绕AD动物模型和筑巢行为研究还有很多工作可做。

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Impairment of Nesting Behavior in Tg-SwDI Mice

Objective:To investigate the differences in the nesting behaviour between Tg-SwDI transgenic mice and wild-type(WT)mice.Methods:Transgenic Tg-SwDI(Tg)and wild-type(WT)mice have been studied to observe their group nest-building behaviors with chip shavings and individual nest-building behaviors with paper towels.Results:The genotype（F1,31=37.03，＜0.0001）and age（F2,31=3.88，＜0.05）had effect on the group nest construction,and the same on the individual nest-building.However,there were no significant differences between Tg and WT mice until 18～20 months.Conclusion:The Tg-SwDI transgenic mice showed a worse nesting compared to WT mice at the early ages when they were group-housed.Most individually housed mice in each group showed impaired nesting behavior in old age(18～20 months).

Alzheimer disease;Tg-SwDI mice;nesting behavior

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.01.001

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉430030

2.郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052

国家自然科学基金（No.81271407）

2013-08-30

张苏明Suming_zhang@163. com